نوع مقاله : مقاله پژوهشی
نویسندگان
1 استادیار ، گروه اصلاح نباتات و بیوتکنولوژی کشاورزی ، دانشکده کشاورزی ، دانشگاه شهرکرد ، شهرکرد ، ایران.
2 شهرکرد شهرکرد-دانشگاه شهرکرد-صندوق پستی 115-دانشکده کشاورزی-گروه اصلاح نباتات و بیوتکنولوژی
3 شیراز شیراز- کیلومتر12 جاده شیراز اصفهان -منطقه باجگاه- دانشکده کشاورزی - گروه زراعت و اصلاح نباتات
4 استاد بخش اصلاح نباتات و بیوتکنولوژی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه شهرکرد، شهرکرد، ایران.
5 استاد موسسه تحقیقاتCSIRO، کنبرا، استرالیا.
چکیده
کلیدواژه‌ها
عنوان مقاله [English]
نویسندگان [English]
RNases participate in vital cellular functions such as DNA replication, transcription, splicing, and control of translation. S-like ribonucleases (S-like RNases) are homologous to S-ribonucleases (S-RNases), but are not involved in self-incompatibility in plants. In dicotyledonous plants, S-like RNases play an important role in phosphate recycling during senescence and are induced by inorganic phosphate-starvation and in response to defense and mechanical wounding. Potensial effects of RNases in drought response might refer to intraction of several different functions. In this study, the promoter of S-Like RNase gene was inserted upstream of β-glucuronidase gene (GUS), Agrobacterium tumefaciens, transformed by electroporation with these constructs were used for co-culture for plant transformation. Histochemical staining method on root, Leaf and anther tissue of rice were done for measering promoter activity. Based on these results, we report tissue speciefic activity of S-Like RNase promoter in the anther of rice. Results indicate the high activity of S-Like RNase promoter in the anther tissue of rice however Expression level in the leaf was low and in the root was negligible. These results is confirmed by previeos studies using q-PCR that indicated high expression of S-Like RNase gene at the anther in comparison with other tissues.
کلیدواژه‌ها [English]
بررسی پروموتر ژن S-Like RNase در برنج تراریخت
رودابه راوش*1، بهروز شیران2، اسماعیل ابراهیمی3، سعد الله هوشمند4، رودی دلفروس5
1 استادیار بخش اصلاح نباتات و بیوتکنولوژی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه شهرکرد، شهرکرد، ایران.
2و4 استاد بخش اصلاح نباتات و بیوتکنولوژی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه شهرکرد، شهرکرد، ایران.
3 دانشیار بخش بیوتکنولوژی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه شیراز، شیراز، ایران.
5 استاد موسسه تحقیقات CSIRO، کنبرا، استرالیا.
تاریخ دریافت: 07/10/1395، تاریخ پذیرش: 23/04/1396
چکیده
گروه ژنهای RNase در فرایندهای حیاتی سلولی همچون همانندسازی DNA، رونویسی، پیرایش و کنترل ترجمه، شرکت میکنند.S-Like ریبونوکلئازها (S-Like RNase)، همولوگS ریبونوکلئاز (S-RNase)ها هستند، ولی آنها در ناسازگاری گیاه مشارکتی ندارند. در گیاهان دو لپهای S-Like RNaseها نقش مهمی در انتقال مجدد فسفات طی فرایند پیری دارند، همچنین آنها در فرایندهای کمبود فسفات معدنی، دفاع سلولی و زخمهای فیزیکی القا میشوند. اثرات RNaseها در پاسخ به خشکی میتواند به دلیل اثرات متقابل بین چندین فعالیت مختلف آنها باشد. در این تحقیق پروموتر ژن S-Like RNase در بالادست ژن بتا گلوکرونیداز (GUS) قرار دادهشد سپس سازه مورد نظر توسط الکتروپوریشن به آگروباکتریوم تومفاسینس، سویه LBA 4404، انتقال دادهشد و سپس به کمک هم کشتی، گیاه تراریخت ایجاد شد. با استفاده از روش رنگآمیزی هیستوشیمیائی فعالیت پروموتر ژن S-Like RNase در بافت ریشه، برگ و بساک برنج بررسی گردید. نتایج نشان داد که پروموتر این ژن دارای فعالیت بالایی در بساک برنج میباشد درحالیکه میزان فعالیت آن در برگ کم و در ریشه نیز ناچیز بودهاست. بررسی بروز پروموتر این ژن در بافتهای مختلف، نتایج بیان بالای ژن S-Like RNase در بساک در مقایسه با بافتهای دیگر که با استفاده از آنالیز q-PCR در مطالعات قبلی مشخص شدهبود را تکمیل و تائید میکند.
کلمات کلیدی: بساک، رنگ آمیزی GUS، فعالیت پروموتر، S-Like RNase، برنج تراریخته.
مقدمه
از آنجایی که پاسخ به تنش‌های زیستی و غیر زیستی شامل عوامل بیوشیمیایی، فیزیولوژیکی، مورفولوژیکی و نموی میباشد، بروز تنش باعث تغییر در محل بروز ژنها در بافتهای گیاه میگردد (Caliskan, 2009). ژن کد کننده β-glucuronidase (GUS) در E. coli، یکی از مهمترین ژنهای گزارشگر است که در تراریزش گیاهان، برای بررسی فعالیت پروموتر بکار بردهمی‌شود (Jefferson, 1987). ژن GUS بعد از بروز، آنزیم بتاگلوکلورونیداز را تولید میکند که این آنزیم وقتی در مقابل پیش‌ماده‌های بی‌رنگ یا غیر فلورسنت قرار گیرد، قادر است آنها را به محصولات رنگی یا فلورسنت، تبدیل کند. رایج ترین پیش‌ماده GUS، برای رنگآمیزی هیستوشیمیایی،5-bromo-4-chloro-3-indolyl glucuronide (X-Gluc) میباشد. محصول واکنش در این روش، به رنگ آبی شفاف، قابل مشاهده است (Blanco et al., 1982).
خانواده RNase T2 در گیاهان، به دو زیر خانواده S-RNase و S-Like RNase طبقهبندی میشوند. S-RNaseها به عنوان عامل ناسازگاری عمل میکنند، ولی S-Like RNaseها که همولوگ S-RNaseها هستند، در ناسازگاری مشارکتی ندارند. S-Like RNase ها خود به دو دسته تقسیم میشوند، دسته اول S-Like RNaseها فقط در گیاهان گزارش شدهاند که به نظر میرسد که بعد از نسخهبرداری ژنی، دارای تنوع میباشند. بسیاری از ژنهائی که در این دسته قرار دارند، در تنظیمات تنش، دفاع در برابر میکروارگانیسمها، انتقال مجدد فسفات و در ذخیره کردن نیتروژن دخالت دارند (MacIntosh, 2011). بر اساس مطالعات بیشتر روی بیان ژن در گیاهان، پیشنهاد شدهاست که دسته اول S-Like RNaseها در چرخه مجدد فسفات طی فرآیند پیری، مشارکت دارند (Kock et al., 1998). مشخص شدهاست که ژن S-Like RNase1 از آرابیدوپسیس، در طی دورههای کمبود فسفات، افزایش بیان داشتهاند (Bariola et al., 1994). در گیاهان دو لپهای S-Like RNaseها نقش مهمی در انتقال مجدد فسفات طی فرایند پیری داشتهاند، همچنین آنها در فرایندهای دفاع سلولی و زخمهای فیزیکی القا شدهاند (Zheng et al., 2014). این ژن در واکنش به برخی از تنشها و بیماریها نیز گزارش شدهاست (Deshpande & Shankar, 2002; MacIntosh et al., 2010). در دسته دوم S-Like RNaseها، بر خلاف دسته اول، خصوصیات اجدادی بیشتر حفظ شدهاند و این گروه به صورت حفاظت شده در میان یوکاریوتها وجود دارند و با تبدیل به RNA ریبوزومی برای نگهداری هموستازی سلولی و به عنوان ژن خانهدار (HouseKeeping) عمل میکنند (Luhtala & Parker, 2010; MacIntosh et al., 2011). اثرات بالقوه یافت شده برای RNaseها در القای مقاومت به خشکی، میتواند ناشی از برهمکنش چندین خاصیت متمایز آنها باشد (MacIntosh et al., 2010)، با این حال تاکنون اطلاعات اندکی در مورد عملکرد ژن S-Like RNase در تک لپهایها گزارش شدهاست.
با جداسازی و توالییابی ناحیه پروموتر ژن در گیاه، میتوان کارکرد دقیقتر آن را مشخص کرد. بهواسطه جداسازی ناحیه پروموتری و قرار دادن ناحیه ژن GUS بعد از آن و انتقال این سازه به گیاه مدل مانند برنج تراریخت، تشخیص فعالیت پروموتر این ژن در بافتهای مختلف گیاه، بواسطه بررسی میزان رنگ تولید شده از بروز ژن GUS، ممکن میگردد. بسیاری از ژنهای اختصاصی بساک و پروموتر آنها، به طور گسترده مورد مطالعه قرار گرفتهاند و منجر به شناسایی عناصر سیس ضروری برای بیان اختصاصی شدهاند (Kuriakose et al., 2009). این پروموترهای اختصاصی بساک میتوانند برای ایجاد نر عقیمی در گیاهان، بهواسطه مهندسی ژنی و قرار دادن ژن سمی بعد از این پروموترها مورد استفاده قرار گیرند (Mariani et al., 1990)، همچنین از این پروموترهای اختصاصی بساک میتوان برای بازیابی باروری گیاه در نسل F1 در گیاهان هیبرید سود جست (Mariani et al., 1992). ژن S-Like RNase در مطالعات بیان ژن تحت تنش خشکی به صورت متفاوتی در بافتهای گندم بروز کردهاست و در اثر تنش خشکی دارای افزایش بیان معنیدار در بساک ارقام مختلف بودهاست (Ravash et al., 2012)، در این تحقیق با استفاده از روش رنگآمیزی GUS، به بررسی فعالیت پروموتر این ژن در بافتهای مختلف برنج تراریخت پرداخته شد.
مواد و روشها
بذور برنج IR64 (واریته هندی) و Nipponbare (رقم ژاپنی) پس از ضد عفونی با محلول الکل 60 درصد به مدت 30 ثانیه و سپس سه بار شستشو با آب مقطر، روی محیط کشت MS قرار گرفتند تا کالوس تازه برای فرآیند تراریختی آماده شود.
توالی کانتیگ ژن S-Like RNase که در بررسی کتابخانه‌های EST در طی تنش خشکی افزایش بیان نشان دادهبود (Ravash et al., 2012)، در پایگاه اطلاعاتی ژنوم برنج (Rice Genome Annotation Project) با آدرس اینترنتی (http://rice.plantbiology.msu.edu/) بلاست شد. توالی کل ژن (LOC_Os09g36700.1)، توالی CDs و توالی پروتئین مربوطه بدست آمد. در قسمت Genome browser محل ژن بر روی کروموزوم برنج مشخص شد. بهمنظور دستیابی به توالی ناحیه پروموتری، حدود 2 کیلو باز قبل از ناحیه ژنی انتخاب شد و توالی مربوطه از این ناحیه بدست آمد. بر اساس توالی بدست آمده برای پروموتر، آغازگر مناسب برای تکثیر آن با استفاده از نرم افزارadvance 11.5.1 Vector NTI طراحی گردید. ناحیه پروموتری بوسیله PCR با آغازگر اختصاصی (جدول 1)، تکثیر شد. واکنش PCR به وسیله دستگاه Rotor-Gene Q از شرکت کیاژن، با حجم نهایی 5/12 میکرولیتر (DNA 1 میکرولیتر، بافر 10x 25/1 میکرولیتر، mgcl2 27/0 میکرولیتر، آغازگر رفت و برگشت هرکدام 25/0 میکرولیتر، dNTP 5/0 میکرولیتر، DNA پلیمراز 13/0 میکرولیتر، DMSO50% 25/1 میکرولیتر و آب مقطر استریل 6/7 میکرولیتر) انجام شد. برنامه واکنش شامل: °C95 به مدت 1 دقیقه و سپس، طی 35 چرخه با °C94 و زمان 30 ثانیه، °C52 به طول 30 ثانیه و °C68 به مدت 1 دقیقه، بود.
جدول 1- مشخصات جفت آغازگرهای استفاده شده در این پژوهش.
Table 1- Names and Sequences of primers have used in this study.
|
طول قطعه تکثیر شده (bp) Size of products (bp) |
دمای اتصال (°C) Annealing tempreture (°C) |
توالی آغازگر)′3-′ (5 Primer sequence )′3-′ (5 |
نام آغازگر Primer name |
ناحیه تکثیر شونده Amplification region |
|
1466 |
52 |
GTGACATCTTGAGCTTGTGTTTG |
Pro-F |
S like RNase Promoter |
|
CTGTGGTCTGTGGAGAAACTCA |
Pro-R |
|||
|
831 |
62 |
GACGATTGCGTCGCATCGACC |
Hph-F |
hygromycin |
|
AGCGTCTCCGACCTGCTGCA |
Hph-R |
ناحیه پروموتری تکثیر شده، با استفاده از کیت شرکت Promega (Cat No. A1360) در ناقل pGEM easy درج و در باکتری همسانهسازی گردید. در این مرحله 96 کلون انتخاب شد و استخراج پلاسمید با استفاده از کیت شرکت Jetstar (Cat No. 210050) صورت گرفت. سپس همه پلاسمید‌های استخراج شده برای توالییابی (به آزمایشگاه توالی یابی CSIRO) ارسال گردیدند تا صحت قطعه پروموتری تکثیر شده تائید گردد. در ادامه ناقل حاوی ناحیه پروموتری بهوسیله هضم مضاعف با آنزیمهای محدود کننده EcoRI و NcoI برش دادهشد و پس از الکتروفورز روی ژل آگارز 5/1 درصد و جداسازی و خالص سازی قطعه از ژل، برای انتقال به ناقل PHW9 آماده شد (شکل 1). این ناقل حاوی ناحیه GUS در پایین دست ناحیه درج قطعه میباشد که توسط (Dolferus et al., (1994 طراحی و ساخته شدهاست. بدین منظور این ناقل با آنزیمهای برشی EcoRI و NcoI برش داده شد. سپس ترانسفورماسیون ناقل pHW9 به باکتری به‌روش شوک حرارتی انجام شد (Dolferus et al.,1994). مجدداً استخراج پلاسمید و توالییابی به منظور یافتن کلونهایی که پروموتر در جهت صحیح در آنها درج شدهبود، صورت گرفت و کلونهایی که در آنها انتهای ناحیه پروموتری در ابتدای توالی کد کننده GUS قرار گرفته بود، انتخاب شدند.
به منظور درج قطعه حاوی پروموتر ژن S-Like RNase و ژن GUS در ناقل pCAMBIA 1300، هردو ناقل pHW9 و pCAMBIA 1300 به وسیله آنزیمهای محدود کننده EcoRI و HindIII برش دادهشدند. پس از انجام واکنش اتصال، ترانسفورماسیون آگروباکتریوم (سویه LBA4404) صورت گرفت. سلول‌های آگروباکتریوم درون محلولSOB (باکتوتریپتون 20 گرم در لیتر، عصاره مخمر5 گرم در لیتر، NaCl 584/0 گرم در لیتر و KCl 186/0 گرم در لیتر به‌همراه آنتی‌بیوتیک‌های ریفامپیسین و کربنسیلین به ترتیب با غلظتهای 50 و 100میلی گرم در میلی لیتر) با غلظت OD600 برابر با 8/0 و میزان 5/0 تا 1 میکروگرم از پلاسمید حاوی سازه، به درون کوت‌های الکتروپوریشن انتقال دادهشدند. سپس کوت‌ها در دستگاه الکتروپوریشن قرار گرفتند (طول پالس: 4- میلی ثانیه, مقاومت: KOhm 4) و درنهایت کلون‌های آگروباکتریوم حاوی سازه بر روی سطح پلیت در دمای °C28 در شرایط تاریکی قرار دادهشدند.
کالوسهای برنج رقم IR6، درون مخلوط حاوی آگروباکتریوم، برای مدت 10 تا 30 دقیقه، غوطه ور شدند و با استفاده از صافی استریل و سپس فیلتر استریل، خشک شدند و طبق روش Lin & Zhang (2005) روی محیط کشت جامد در دمای °C25 به مدت 2 تا 3 روز در تاریکی قرار گرفتند و پس از چند بار، بازکشت کالوسهای سالم روی محیط کشتهای مختلف، کالوس‌هایی که در مرحله قبل دارای شاخساره شدهبودند به محیط کشت ½ MS منتقل شدند و در نور کامل (75 میکرومول بر مترمربع بر ثانیه) به مدت 10 تا 14 روز نگه داری شدند. کالوس‌هایی که هم دارای ریشه و هم شاخساره شدهبودند انتخاب شدند و به داخل گلدانهای مقوایی کوچک انتقال دادهشدند و در اطاق مه پاشی در فایتوترون (با دمای °C25) قرار گرفتند. در نهایت پس از 7 تا 10 روز که گیاهچهها به خوبی در خاک مستقر شدند، به گلدانهای معمولی انتقال دادهشدند و در گلخانه نگهداری شدند، این روش توسط horsch et al., (1985) به طور مفصلتری شرح دادهشدهاست.
شکل 1- ناقل pHW9 حاوی ناحیه GUS در پایین دست ناحیه درج قطعه موردنظر (Dolferus et al., 1994).
Figure 1- pHW9 vector include GUS gene at downstream of insertion site (Dolferus et al., 1994)
برای تائید حضور سازه حاوی پروموتر در برنج تراریخت، استخراج DNA از بافت برگ گیاهچهها با روش Dellaporta et al., (1983) انجام گرفت و نمونهها با آغازگر اختصاصی هایگرومایسین (جدول 1) تکثیر شدند. واکنش PCR با حجم نهایی 5/12 میکرولیتر انجام شد. برنامه واکنش شامل: °C95 به مدت 1 دقیقه و سپس طی 35 چرخه با °C94 برای 30 ثانیه، °C62 برای 30 ثانیه و°C68 به مدت 1 دقیقه، بود. گیاهچههای تراریخت به گلدانهای حاوی شن و ورمیکولایت که به نسبت مساوی مخلوط شدهبودند، انتقال یافتند و تا مرحله بذر دهی رشد دادهشدند و نمونه گیری از بافت ریشه، برگ و بساک در مرحله میکروسپور جوان انجام شد.
در مرحله رشد زایشی گیاهان تراریخت، نمونه برداری از بافت برگ، ریشه و خوشه برنج انجام گرفت. برای بررسی میزان فعالیت پروموتر در بافتهای مورد نظر، نمونهها در میکروتیوب قرار دادهشدند و حدود 500 میکرولیتر محلول رنگ آمیزی GUS (De Block & Debrouwer, 1992) درون میکروتیوب‌ها ریخته شد به طوری‌که روی سطح نمونهها را بپوشاند، سپس میکروتیوب‌ها در دستگاه تغلیظ کننده با پمپ خلاء قرار دادهشدند و پس از گذشت چند ثانیه از ایجاد خلاء، پمپ خلاء خاموش شد و این عمل 3 بار تکرار گردید تا محلول رنگ آمیزی GUS به خوبی در بافت‌ها نفوذ کند. نمونهها در انکوباتور با دمای °C37 برای مدت یک شب، قرار داده شدند و سپس با آب مقطر چندین بار شستشو شدند. در نهایت در محلول 70% اتانول و سپس در محلول 100% اتانول نگهداری شدند. عکس‌برداری از نمونهها بهوسیله میکروسکوپ نوری با بزرگنمایی‌های متفاوت صورت گرفت.
نتایج و بحث
نتایج مطالعات گذشته نشان دادهاست که بیان ژن S-Like RNase در بساک رقم‌ها و گونه‌های مختلف گندم و خویشاوندان وحشی آن، بسیار بالاتر از بقیه بافت‌ها بودهاست (Ravash et al., 2012). بر همین اساس در این مطالعه پروموتر این ژن برای برآورد فعالیت آن در بافتهای مختلف، شناسایی و جداسازی شد. ناحیه پروموتری در بالادست توالی کانتیگ S-Like RNase بر روی کروموزوم شماره 9 برنج، شناسایی شد (AP014965.1).
قطعه تکثیری پروموتر در ناقل pGEM -T easy درج گردید و همسانهها برای تولییابی ارسال شدند. این توالی در پایگاه اطلاعاتی برنج بلاست شد و با توالی‌ژن S like RNase روی کروموزوم شماره 9 برنج جفت گردید (LOC_Os09g36700.1). سپس پروموتر در ناقل pHW9 درج شد و سپس توالییابی و مورد بررسی قرار گرفت. پس از اطمینان از صحت قطعه تکثیری، پروموتر به ناقلpCAMBIA 1300 وارد شد، و در نهایت ترانسفورماسیون آگروباکتریوم سویه LBA 4404 صورت گرفت.
سازه حاوی پروموتر و ناحیه ژن GUS در ناحیه جایگاه برشی چندگانه (MCS) به ناقلpCAMBIA 1300 وارد شد. این ناقل قابلیت ترانسفورماسیون به داخل سلول گیاهی را دارد و امکان بررسی رفتار پروموتر را در گیاهان تراریخت شده، مهیا میکند (شکل 2).
برای یافتن ناقلهایی که سازه به طور کامل وارد آنها شدهبود، نمونهی ناقلpCAMBIA1300 با آنزیمهای EcoRI و HindIII که جایگاه برشی آنها در دو سوی محل قرار گیری سازه حاوی پروموتر قرار داشت، مورد هضم مضاعف قرار گرفتند. نمونهها روی ژل برده شدند و نمونههایی که دارای باند 1500 جفت بازی بودند، انتخاب شدند و برای توالییابی ارسال شدند.
شکل 2- نقشه ناقل pCAMBIA1300، سازه در ناحیه جایگاه برشی چندگانه (MCS) به ناقل وارد شد (http://www. cambia.org).
Figure 2- pCAMBIA1300 map, construct was inserted in MCS site (http://www. cambia.org).
هم کشتی باکتری با کالوس رقم هندی IR6 انجام شد و روی محیط کشت، گیاهچهها تولید برگ و ریشه نمودند و در نهایت گیاه تراریخت ایجاد شد.
شکل 3 مراحل مختلف رشد کالوس و ایجاد گیاه تراریخت را نشان میدهد. در شکل3 a، تغییر رنگ و سبزشدن کالوس‌ها و نمایان شدن برگ در برخی از آنها، در شرایط نیمه تاریک نشان دادهشدهاست. بهمنظور ایجاد گیاهچه از کالوسهای سبز و یا دارای برگ کوچک، کالوس‌ها به محیط کشت بعدی و شرایط نوری کامل انتقال دادهشدند (شکل 3 b و c). در این مرحله از پلیت‌های بلند‌تر استفاده شد تا فضای رشد کافی برای رشد برگ‌ها وجود داشته باشد، همچنین نوار میکروپور برای درزگیری درب پلیت‌ها استفاده شد تا امکان عبور هوا فراهم باشد. استفاده از نوارهای میکروپور نسبت به پارافیلم، کارایی تولید گیاه تراریخت را افزایش میدهد. شکل3 d، رشد گیاهچهها در محیط کشت ½ MS، را نشان میدهد که آماده برای انتقال به گلدانهای مقوایی حاوی خاکبرگ و خاک ماسه‌ای و قرار گرفتن در اتاقک مه‌پاشی میباشد. در نهایت، گیاهان کوچک تراریخت به گلخانه برنج با شرایط دمایی °C33 و رطوبت بالای 70 درصد، انتقال داده‌شده‌اند.
|
شکل 3- مراحل مختلف کشت بافت کالوس برنج تراریخت: a- سبز شدن کالوس‌ها b- ایجاد گیاهچه از کالوس‌ها، c- انتقال گیاهچه به پلیت با ارتفاع بیشتر همراه با نوارهای درزبندی انتقال دهنده هوا، d- گیاهان تراریخت درون محیط کشت ½ MS.
Figure 3- Transformed rice tissue culture stages: a- callus getting green, b- produce seedling from callus, c- transform callus to plate with micropore tape, d- transformed plants at ½ MS media.
برای تایید گیاهچههای تراریخت حاوی قطعه T-DNA، واکنش PCR با استفاده از آغازگرهای اختصاصی ژن هایگرومایسین صورت گرفت. ناقل pCAMBIA1300 دارای ناحیه ژن هایگرومایسین درقسمتی از توالی خود هست (جدول 1). نمونههایی که بر روی ژل، دارای یک باند 831 جفت بازی بودند، گیاه تراریخت مثبت ارزیابی شدند و برای ادامه مراحل بررسی بیان ناحیه پروموتری، در نظر گرفته شدند عکس ژل‌های تایید کننده حضور ژن در نمونه‌های مختلف برنج تراریخت در شرایط یکسان رنگ آمیزی شدند (شکل 4). نتایج نشان داد که هیچیک از کالوسهای رقم ژاپنی تراریخت نشدند، ولی رقم هندی، رقم مناسبی برای ایجاد گیاهچههای تراریخت بود.
شکل 4- الکتروفورز محصول PCR روی ژل آگارز به منظور تشخیص گیاهچههای برنج تراریخت با استفاده از آغازگر هایگرومایسین. چاهک (M): نشانگر100 bp plus ؛ چاهک (1-6): محصولات PCR نمونه های مختلف برگی.
Figure 4- Agarose electrophoresis gel of PCR products for detecting transformed rice seedling using hygromycin primer. Lane (M): 100 bp plus size marker; lane (1-6): PCR products from various leaf samples
آزمون تشخیص GUS در واقع بسیار حساس و اختصاصی عمل کرده و دارای قابلیت‌های بررسی کمی (اندازه‌گیری میزان بیان ژن GUS) و نیز کیفی (بررسی الگوی بیان ژن GUS در بافت‌ها و اندام‌ها‌ی مختلف) میباشد. بررسی میزان بیان ژن GUS که در واقع میزان فعالیت پروموتر ژن S-Like RNase را مشخص میکند، نشان داد که این ژن دارای بیان بسیار بالایی در بساک میباشد و بیان آن در برگ کمتر و در ریشه نیز ناچیز بودهاست. نتایج در تعداد زیادی نمونه از بافتهای مختلف و در گیاهچههای تراریخت متعدد تکرار شد و در تمامی موارد شدت رنگ آبی در بساک بسیار زیاد بود که نشاندهنده فعالیت بالای پروموتر قبل از ناحیه GUS در این بافت میباشد، در صورتی‌که فعالیت پروموتر S-Like RNase در برگ زیاد نبودهاست، در نتیجه میزان رنگ آبی مشاهده شده پس از رنگآمیزی برگ، مختصر بوده است. در ریشه فعالیت بسیار ناچیزی از این پروموتر دیده میشود که در نتیجه آن، ریشهها کاملا سفید رنگ با رگههای مختصر آبی پراکنده، مورد مشاهده و ارزیابی قرار گرفتند (شکل 5). از آنجایی‌که بررسی میزان بیان ژن S-Like RNase نشان دادهبود که بیان این ژن در بساک رقم‌ها و گونه‌های مختلف گندم و خویشاوندان وحشی آن، بسیار بالاتر از بقیه بافت‌ها بودهاست (Ravash et al., 2012)، و در این مطالعه نیز بیشترین فعالیت پروموتر ژن S-Like RNase در فعال کردن ژن GUS در بافت بساک بودهاست، میتوان نتیجه گرفت که یکی از دلایل اساسی تفاوت در میزان بیان این ژن در بافتهای مختلف به دلیل تفاوت در فعالیت پروموتر این ژن در بافتهای مختلف بودهاست (شکل 5). محققان دیگری نیز فعالیت متفاوت ژنها و پروموترها را در بافتهای مختلف را گزارش نموده‌اند، به عنوان مثال ژن CSDC9 که به ژن GUS ملحق شدهبود، بیان اختصاصی در بافت گلبرگ و ساقه گیاه میخک نشان دادهاست (Kim et al., 2004). همچنین پروموتر ژن YY2 دارای فعالیت اختصاصی در بساک برنج و آرابیدوپسیس میباشد که یک ژن کلیدی در چرخه تولید فلاوانوئید میباشد Kuriakose et al., 2009)).
RNaseها که زیر فامیل خانواده RNase T2 هستند، در ژنوم تمام گیاهانی که تا کنون مطالعه شدهاند، یافت میشوند، اما تا کنون اطلاعات دقیقی در مورد نحوه عملکرد پروموتر آنها در بافتهای مختلف در دست نبودهاست. اگر چه مطالعات بروز ژن مشخص کردهبود که این ژن در فرایند تنش در برنج پاسخ میدهد ولی مطالعهای روی پروموتر این ژن صورت نگرفته بود (Zheng et al., 2014; Salekdeh et al., 2002). در این تحقیق به بررسی محل بروز پروموتر این ژن در بافتهای مختلف برنج تراریخت پرداخته شده است.
|
|
شکل 5- بررسی میزان فعالیت اختصاصی پروموتر ژن S-Like RNase در بافتهای مختلف برنج تراریخت با استفاده از آزمون تشخیص GUS a- ریشه، b- برگ، c- بساک، d- گلچه.
Figure 5- GUS Reporter gene expression assay for Analysis of S-Like RNase promoter tissue-specific expression patterns in transformed plants tissues: a- root, b- leaf, c- anther, d- floret.
بروز متفاوت ژن S-Like RNase در بافتهای مختلف گندم و خویشاوندان وحشی آن، در مطالعات گذشته انجام شدهبود که بر اساس آن این ژن در بین بافتهای مختلف گندم، بیشترین بیان را در بساک دارا بودهاست و تحت تنش خشکی بیان این ژن افزایش یافتهاست، همچنین در بساک خویشاوند وحشی گندم (Aegilops tauschii)، افزایش بیان تحت تنش خشکی، بسیار بالا بودهاست (Ravash et al., 2012). با توجه به نتایج قبلی، نقش بافت اختصاصی پروموتر این ژن، تخمین زده میشد که در این تحقیق با اثبات فعالیت بالای این پروموتر در بساک برنج، علت بروز بالای ژن s-like RNase در این بافت و بیان کم این ژن در بافتهای دیگر، مشخص شد. با توجه به نتایج این آزمایش، وجود بیان اختصاصی پروموتر ژن S-Like RNase در بساک برنج برای اولین بار گزارش شد و پروموتر از برنج جداسازی و توالییابی شد و محل دقیق بروز آن در بساک، به وسیله تکنیک تشخیص GUS مورد بررسی قرار گرفت.
در این تحقیق مراحل هم کشتی باکتری با کالوس دو رقم برنج (IR64 و Nipponbare) پی‌گیری شد. کالوسهای ایجاد شده از هر دو رقم هندی و ژاپنی تا مرحله القای گیاهچه پیش رفتند، اما رقم ژاپنی پاسخ مناسبی نداشت و فقط کالوسهای رقم هندی، تولید برگ و ریشه نمودند و در نهایت گیاه تراریخت به طور موفق، ایجاد شد. نکته حائز اهمیت در این کار این بود که با توجه به برهمکنش عوامل مختلف در تراریزش و باززایی گیاهان تراریخت، کار با ارقام ژاپنی و هندی برنج دنبال گردید و به این ترتیب علی‌رغم عدم ایجاد ارقام ژاپنی تراریخت، روند انتقال پروموتر به گیاه و باززایی برنج هندی، کاملا موفقیت آمیز و با کارآیی بالا، ارزیابی شد. در تحقیقات گذشته ثابت شدهاست که تراریزش با اگروباکتریوم به نوع ژنوتیپها و واریتههای مورد آزمایش بستگی دارد و فقط تعداد محدودی از واریتهها تراریخته میشوند، که اساسا به علت تفاوتهای زیاد در توانایی تولید کالوس و باززایی در میان واریتههای مختلف پس از آلودهسازی با اگروباکتریوم اتفاق میافتد (Machii et al., 1998). مطالعات دیگری نیز بر روی بروز ژن GUS در بافت های مختلف نشان دادهاست فعالیت پروموتر در بافت های مختلف و تحت تاثیر شرایط مختلف تنش متفاوت بوده است (Hashemi et al., 2012). نتایج این تحقیق در شناسایی پروموتر با بیان اختصاصی در بافت مشخص، میتواند در مطالعات بررسی اثر یک ژن خاص در یک بافت بخصوص بسیار مفید و کاربردی باشد. پروموتر بافت اختصاصی میتواند برای بررسی تشدید بیان یک ژن در فعالیت‌های متابولیکی و ساختاری بافت، طی شرایط تنش مورد استفاده قرار گیرد. در مراحل بعدی تحقیق پیشنهاد میشود، روی لاینهای جهش یافته فاقد این ژن و مورفولوژی این گیاهان جهش یافته، تحت شرایط تنش خشکی و نرمال مقایسه انجام شود تا نقش این ژن و پروموتر اختصاصی آن در شرایط تنش، روشنتر گردد.
سپاسگزاری
با سپاس از همکاری موسسه CSIRO در استرالیا که منابع مالی این پژوهش را تامین نمودند و موافقت نمودند که انجام این تحقیق در آزمایشگاه بخش plant industry و در فایتوترون این موسسه صورت گیرد.
منابع
Bariola PA, Howard CJ, Taylor CB (1994). The Arabidopsis ribonuclease gene RNS1 is tightly controlled in response to phosphate limitation. Plant Journal 6: 673–685.
Blanco C, Ritzenthaler P, Mata-Gilsinger M (1982). Cloning and endonuclease restriction analysis of uidA and uidR genes in Escherichia coli K-12: determination of transcription direction for the uidA gene. Journal of Bacteriol 149: 587–594.
Caliskan M (2009). Salt stress causes a shift in the localization pattern of germin gene expression. Genetic Molecular Research 8: 1250-1256.
De Block M, Debrouwer D (1992). In-situ enzyme histochemistry on plastic-embedded plant material. The development of an artefact-free β-glucuronidase assay. The Plant Journal 2: 261-266.
Deshpande RA, Shankar V (2002). Ribonucleases from T2 family. Critical Reviews in Microbiology 28: 79–122.
Dolferus R, Jacobs M, Peacock WJ, Dennis ES (1994). Differential Interactions of Promoter Elements in Stress Responses of the Arabidopsis Adh Gene. Plant Physiology 105(4):1075-1087.
Hashemi F, Shobbar ZS, Majidi MM (2012). Functional Analysis of OsVP1 Using Rice Mutant Lines. Journal of agricultural Biotechnology 4(2): 89-102. (In Farsi)
Horsch R, Fry J, Hoffman N, Eichholtz D, Rogers S, Fraley R (1985). A simple and general method for transferring genes into plants. Science 227: 1229–1231.
Jefferson R (1987). Assaying chimeric genes in plants: The GUS gene fusion system. Plant Molecular Biology Reporter 5: 387-405.
Kim YJ, Sun HL, Park KY (2004). A leader intron and 115‐bp promoter region necessary for expression of the carnation S‐adenosylmethionine decarboxylase gene in the pollen of transgenic tobacco. FEBS letters 578(3): 229-235.
Kock M, Theierl K, Stenzel I (1998). Extracellular administration of phosphate-sequestering metabolites induces ribonucleases in cultured tomato cells. Planta 204: 404–407.
Kuriakose B, Arun V, Gnanamanickam SS, Thomas G (2009). Tissue-specific expression in transgenic rice and Arabidopsis thaliana plants of GUS gene driven by the 50 regulatory sequences of an anther specific rice gene YY2. Plant Science 177: 390–397.
Lin YJ, and Qifa Zhang (2005). Optimising the tissue culture conditions for high efficiency transformation of indica rice. Plant cell reports 23(8): 540-547.
Luhtala N, Parker R (2010). T2 family ribonucleases: ancient enzymes with diverse roles, Trends in Biochemical Sciences 35: 253–259.
Machii H, Mi zuno H, Hi rabayashi T, Li H, Hagio T (1998). Screening wheat genotypes for high callus inducti on and regeneration capability from anther and immature embryo cultures. Plant Cell, Tissue and Organ Culture 53: 67-74.
MacIntosh G, Hillwig M, Meyer A, Flagel L (2010). RNase T2 genes from rice and the evolution of secretory ribonucleases in plants. Molecular Genetics and Genomics 283: 381–396.
MacIntosh GC (2011). RNase T2 family: enzymatic properties, functional diversity, and evolution of ancient ribonucleases. in: Nicholson AW (Ed.), Ribonucleases, Springer, Berlin, Heidelberg 89–114.
Mariani C, DeBeuckeleer M, Truettner J, Leemans J, Goldberg RB (1990). Induction of male sterility in plants by a chimaeric ribonuclease gene. Nature 347: 737–741.
Mariani C, Gossele V, DeBeuckeleer M, De Block M, Goldberg RB, DeGreef W, Leemans J (1992). A chimaeric ribonuclease inhibitor gene restores fertility to male sterile plants. Nature 357: 384–387.
Ravash R, Shiran B, Ebrahimie E, Houshmand SA (2012). Study of S-Like RNase expression in wheat and its wild relatives under drought stress. Journal of agricultural Biotechnology 5(1): 27-38. (In Farsi)
Salekdeh GH, Siopongco J, Wade LJ (2002). Proteomic analysis of rice leaves during drought stress and recovery. Proteomics 2: 1131-1145.
Zheng J, Wang Y, He Y, Zhou J, Li Y, Liu Q, Xie X (2014). Overexpression of an S-like ribonuclease gene, OsRNS4, confers enhanced tolerance to high salinity and hyposensitivity to phytochrome-mediated light signals in rice. Plant Science 214: 99-105.
Promoter Analysis of S-Like RNase gene in Transgenic Rice
Ravash R.1*, Shiran B.2, Ebrahimie E.3, Houshmand S.4, Dolferus R.5
1Assistant Professor, Plant Breeding and Biotechnology Department, Faculty of Agriculture, Shahrekord University, Shahrekord, Iran.
2,4Professor, Plant Breeding and Biotechnology Department, Faculty of Agriculture, Shahrekord University, Shahrekord, Iran.
3Professor, Plant Breeding and Biotechnology Department, Faculty of Agriculture, Shiraz University, Shiraz, Iran.
5 Professor, CSIRO Plant Industry, Canberra-Australia.
Abstract
RNases participate in vital cellular functions such as DNA replication, transcription, splicing, and control of translation. S-like ribonucleases (S-like RNases) are homologous to S-ribonucleases (S-RNases), but are not involved in self-incompatibility in plants. In dicotyledonous plants, S-like RNases play an important role in phosphate recycling during senescence and are induced by inorganic phosphate-starvation and in response to defense and mechanical wounding. Potensial effects of RNases in drought response might refer to intraction of several different functions. In this study, the promoter of S-Like RNase gene was inserted upstream of β-glucuronidase gene (GUS), Agrobacterium tumefaciens, transformed by electroporation with these constructs were used for co-culture for plant transformation. Histochemical staining method on root, Leaf and anther tissue of rice were done for measering promoter activity. Based on these results, we report tissue speciefic activity of S-Like RNase promoter in the anther of rice. Results indicate the high activity of S-Like RNase promoter in the anther tissue of rice however Expression level in the leaf was low and in the root was negligible. These results is confirmed by previeos studies using q-PCR that indicated high expression of S-Like RNase gene at the anther in comparison with other tissues.
Keywords: Anther, GUS staining, Promoter activity, S-Like RNase, Transformed Rice.
)
