بررسی اثر بهینه‌سازی کدونی بر میزان بیان نانوبادی Anti-VEGF

بررسی اثر بهینه‌سازی کدونی بر میزان بیان نانوبادی Anti-VEGF

مژگان سلیمانی زاده¹، عبدالرضا باقری²، مختار جلالی جواران³*، علیرضا سیفی⁴، مهدی بهدانی⁵، فاطمه کاظمی لمعه دشت⁶

¹دانشجوی دکتری بیوتکنولوژی کشاورزی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه فردوسی مشهد، مشهد، ایران.

²استاد گروه بیوتکنولوژی و به‌‌نژادی گیاهی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه فردوسی مشهد، مشهد، ایران.

³دانشیار گروه بیوتکنولوژی کشاورزی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه تربیت مدرس، تهران، ایران.

⁴استادیار گروه بیوتکنولوژی و به‌‌نژادی گیاهی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه فردوسی مشهد، مشهد، ایران.

⁵دانشیار بخش بیوتکنولوژی، مرکز تحقیقات بیوتکنولوژی، انستیتوپاستور ایران، تهران، ایران.

⁶استادیار بخش بیوتکنولوژی، مرکز تحقیقات بیوتکنولوژی، انستیتوپاستور ایران، تهران، ایران.

تاریخ دریافت: 15/09/1396، تاریخ پذیرش: 30/10/1396

چکیده

گیاهان به‌دلایل متعددی به‌عنوان بیوراکتورهای ارزشمند برای تولید انواع پروتئین‌های نوترکیب (به‌ویژه آنتی‌بادی‌های مونوکلونال و...) می‌توانند مورد بهره‌برداری قرار گیرند. استفاده از ناقل‌های ویروسی گیاهی برای بیان موقت، یک استراتژی مفید برای تولید پروتئین‎های مهم دارویی از قبیل آنتی‎بادی‌ها در مقیاس بالا و در یک دوره زمانی خیلی کوتاه پیشنهاد می‎شود. امروزه، سرطان دومین عامل مرگ و میر در جامعه بشری است. شواهد قانع کننده نشان می‌دهد که فاکتور رشد اندوتلیال عروقی (VEGF) به‌دلیل نقش ضروریش در رگزایی یک هدف مهم برای درمان سرطان می‌باشد. در این مطالعه قطعات مختلف نانوبادیAnti-VEGF (Nb42) به‌طور موقت تحت کنترل راه‌انداز قوی ویروسی در گیاه کدو با استفاده از ناقل ویروسی مبتنی بر ZYMV بیان گردید. این قطعات شامل توالی معمولی نانوبادی (Nb42I) و توالی بهینه شده نانوبادی برای بیان در گیاه (Nb42II) بودند. پس از مایه‌کوبی گیاهان، حضور رونوشت‌های قطعات مختلف ژنی Nb42 در گیاهان مایه‌کوبی شده کدو با استفاده از آزمون‌RT-PCR  شناسایی گردید. همچنین بیان پروتئین‌‌ نوترکیب با استفاده از آزمون‌های لکه‌گذاری نقطه‌ای، SDS-PAGE، لکه‌گذاری وسترن و الایزا تائید گردید. بر اساس نتایج الایزا، میزان بیان نانوبادی  Nb42Iو Nb42II به ترتیب 2 و 8/6 میکروگرم در هر گرم بافت برگی بود. در مجموع، نانوبادی نوترکیب Nb42 می‎تواند به‌طور موثر در گیاه کدو بیان گردد و سیستم بیانی مبتنی بر ZYMV یک سیستم تولیدی مناسب برای بیان پروتئین‌های نوترکیب در گیاهان خانواده کدوئیان خواهد بود.

کلمات کلیدی: بیان موقت، بهینه‌سازی کدونی، زراعت مولکولی، ناقل ویروسی، نانوبادی.

مقدمه

بروز سرطان در کشورهای در حال توسعه و توسعه یافته در حال افزایش می‌باشد. بنابراین تولید مولکول‌های ارزان و جدید برای درمان سرطان ضروری می‌باشد (Pereira et al., 2011). درمان‌های سرطان شامل شیمی درمانی، جراحی و دیگر درمان‌های طولانی مدت سرطان را گرانترین بیماری برای درمان می‌سازد (Moussavou et al., 2015). مطالعات آزمایشگاهی و بالینی نشان داده است که یکی از پاسخ‌های ضد توموری تولید تعداد زیادی از آنتی‌بادی‌ها برای کشتن مستقیم سلول تومور، کشتن سلول تومور بواسطه ایمنی‌زایی و ریشه‌کنی عروق[1] می‌باشد (Scott et al., 2012). درمان سرطان با آنتی‌بادی مونوکلونال به‌دلیل قیمت بالا، آلودگی بالقوه به عوامل بیماریزای انسانی و مقیاس‏پذیری محدود سیستم سلولی پستانداران کاربرد گسترده‏ای ندارد (Moussavou et al., 2015). کارخانه‌های سلولی گیاهی روش ایمن‌تر و ارزانتری برای تولید آنتی‌بادی‌های مونوکلونال ضد سرطان ارائه می‌دهند و به‌دلیل مقیاس‌ پذیری بالا[2]، قیمت پایین تولید و توانایی سرهم کردن آنتی‌بادی مونوکلونال مورد توجه ویژه قرار دارند (Ma et al., 2003; Moussavou et al., 2015).

زراعت مولکولی، استفاده از گیاهان به‌عنوان ابزارهایی برای تولید پروتئین‌های نوترکیب ارزشمند از قبیل پروتئین‌های داروئی و صنعتی می‌باشد. در سال 1989 اولین آنتی‌بادی مونوکلونال در گیاهان تراریخته تولید شد (Hiatt et al., 1989). از آن زمان تاکنون شکل‌های مختلفی از آنتی‌بادی‌های مونوکلونال در سیستم‌های گیاهی با استفاده از سیستم‌های بیانی موقت مبتنی بر ویروس یا تراریختی پایدار تولید شده‌اند. برای تولید گیاهان تراریخته پایدار زمان زیادی لازم است و عملکرد پروتئین معمولا پایین می‌باشد (Huang et al., 2010). در مقابل، بیان موقت با استفاده از ناقل‌های ویروسی گیاهی یک راهبرد امیدوار کننده برای تولید سریع سطوح بالای پروتئین خارجی در گیاهان می‌باشد (Lico et al., 2008). ویروس موزائیک زرد کدو[3] به‌عنوان یک ناقل مبتنی بر پوتی‌ویروس[4] برای بیان موقت پروتئین‌های نوترکیب در گیاهان خانواده کدوئیان دستورزی شده است (Hsu et al., 2004).

رگزایی[5]، یک فرایند چند مرحله‌ای بسیار کنترل شده شامل تکثیر سلول‌های اندوتلیال، سازماندهی سلول‌ها به ساختارهای لوله‌ای و بلوغ ساختارهای لوله‌ای به شکل رگ‌های پایدار می‌باشد (Folkman, 1971). در شرایط ایجاد تومور، رگزایی منجر به رشد، تهاجم و متاستاز سرطان می‌گردد (Behdani et al., 2012). فاکتور رشد اندوتلیال عروقی (VEGF)[6]، یک مولکول کلیدی در رگزایی تومور بوده و توسط سلول‌های سرطانی در هنگام سرطان تولید می‌شود. از آنجایی که میان‏کنش VEGF با گیرنده‌های آن برای رگزایی تومور ضروری به نظر می‌رسد، بنابراین مهار VEGF می‌تواند به‌عنوان یک رویکرد جذاب برای درمان سرطان محسوب گردد (Ebrahimizadeh et al., 2015).

آنتی‌بادی‌های مونوکلونال خنثی‏کننده علیه VEGF گروه مهمی از داروهای مورد استفاده برای درمان سرطان می‌باشند. مطالعات اخیر روی توسعه آنتی‌بادی‌ها به‌ویژه آنتی‌بادی‌های مونوکلونال و مولکول‌های کوچک که سلول‌های اندوتلیال مرتبط با تومور را هدف قرار می‌دهد، متمرکز شده است (Youssoufian et al., 2007; Zhang et al., 2009). علی‌رغم موفقیت های مهم و مزیت آنتی‌بادی‌های مونوکلونال از نظر اتصال به یک هدف خاص، هنوز هم این آنتی‌بادی‌ها محدودیت‌هایی دارند. نگرانی‌های از جمله قیمت بالای تولید، تحریک پاسخ ایمنی، دشواری نفوذ به بافت‌های متراکم از قبیل تومورهای فشرده، نیاز به فرآیندهای تولید و اندازه بزرگ از آن جمله می باشند (Kolkman & Law, 2010).

شناسایی نانوبادی‏ها زمینه‎ای جدید در فن‏آوری آنتی‏بادی ایجاد کرده است. در واقع نانوبادی، یک نوع منحصر به‌فرد از قطعات عملکردی آنتی‌بادی است که در سرم خون شترسانان موجود می‌باشد. زنجیره سنگین آنتی‌بادی شتری تنها از طریق یک دومین متغیر اقدام به شناسایی آنتی‌ژن می‌نماید که به این دومین متغیر، نانوبادی اطلاق می‌گردد (Muyldermans et al., 2009). نانوبادی‌ها به‌دلیل داشتن ویژگی‌های منحصر به‌فردی از قبیل: همسانه‏سازی آسان، ایمنی‌زایی کم، وزن مولکولی پایین (15 کیلو دالتون)، تولید ارزان، حلالیت و پایداری بالا، اختصاصیت و تمایل بالا برای اتصال به آنتی‌ژن کاندیدهای جالبی برای درمان سرطان می‌باشند (Behdani et al., 2012; Kazemi-Lomedasht et al., 2015).

یکی از چالش‌های اصلی برای تولید پروتئین‌های نوترکیب در سیستم‌های بیانی گیاهی عملکرد پایین پروتئین نوترکیب می‌باشد. بهینه‌سازی کدونی یکی از رویکردهای مولکولی جهت حل این چالش می‌باشد. بهینه‌سازی کدونی یک استراتژی برای تغییر محتوی کدونی توالی ژن هدف مطابق با ترجیح کدونی گیاه میزبان می‌باشد. نشان داده شده است که کدون‌های هم معنی می‌توانند به‌طور معنی‌داری بیان پروتئین هدف را با کنترل تنظیم کارایی ترجمه تغییر دهند، لذا برای بیان موثر، ژن هدف بایستی مطابق با الگوی ژنوم میزبان طراحی گردد (Tian et al., 2017; Webster et al., 2017). هدف از این تحقیق استفاده از یک ناقل ویروسی مبتنی بر پوتی‌ویروس برای بررسی اثر بهینه‌سازی کدونی، بر میزان بیان ژن نانوبادی Nb42 در گیاه کدو بود. در ابتدا قطعات ژنی مختلف نانوبادی در ناقل ویروسی مورد نظر همسانه‌سازی گردید و پس از مایه‌کوبی گیاهان موردنظر، بررسی بیان گیاهان مایه‌کوبی شده در سطح RNA با آزمون RT-PCR و در سطح پروتئین با آزمون‌های لکه‌گذاری نقطه‌ای[7]، SDS-PAGE[8]، لکه‌گذاری وسترن[9] و الایزا [10] انجام گرفت. در این تحقیق ما برای اولین بار اثر بهینه‌سازی کدونی را بر میزان بیان ژن نانوبادی Nb42 با استفاده از سیستم بیانی ویروسی در گیاه کدو بررسی نمودیم.

مواد و روش‌ها

بذور گیاه کدو (Cucurbita pepo L.) به‌عنوان میزبان اصلی در اتاقک رشد در شرایط دمایی °C2  ±25، 16 ساعت روشنایی و 8 ساعت تاریکی کشت داده شدند. برای بستر کاشت گلدان‌ها از خاک استریل در ترکیب با کمپوست و ورمیکولیت با نسبت حجمی 2:1:1 استفاده شد.

دو قطعه مختلف از ژن نانوبادی Nb42 (با توالی آمینواسیدی مشابه) مورد بررسی قرار گرفت. توالی کد کننده ژن نانوبادی بهینه نشده (Nb42I) توسط آزمون PCR و با استفاده از آغازگرهای اختصاصی NbF1 و NbR1 (جدول1) از ناقل pHEN6c-Nb42 (تهیه شده توسط دکتر کاظمی، انسیستو پاستور ایران) تکثیر گردید. قطعه ژنی نانوبادی بهینه شده (Nb42II) به‌طور مشابه با استفاده از آغازگرهای اختصاصی NbF2 و NbR2 (جدول1) از ناقل pUC57 در بردارنده ژن هدف (pUC57-Nb42HFBI، تهیه شده از آزمایشگاه بیوتکنولوژی کشاورزی، دانشگاه تربیت مدرس) تکثیر شد.

درج فرآورده‌های تکثیر شده PCR در ناقل همسانه‌سازی pJET (فرمنتاز، شماره دسترسی ژن بانک EF694056.1) مطابق با دستورالعمل کیت K1232 شرکت فرمنتاز انجام گرفت. ناقل‌های نوترکیب حاصل به ترتیب pJETNb42I و pIETNb42II نامگذاری شدند و سپس با استفاده از روش شوک حرارتی به سلول‌های مستعد باکتری E. coli سویه DH5α منتقل شدند (Sambrook & Russell, 2001). آزمون Colony PCR برای انتخاب کلنی‌‌‌های مثبت حاوی قطعات ژنی‌ هدف از بین سایر کلنی‌ها، با استفاده از آغازگرهای pJET1.2 F و pJET1.2 R انجام گرفت (جدول 1). پس از استخراج پلاسمید از کلنی‌های رشد یافته در محیط LB مایع حاوی آنتی‌بیوتیک با استفاده از کیت Exprep Plasmid SV–mini و بر اساس دستورالعمل شرکت سازنده (GenaAll، کره جنوبی)، هضم آنزیمی پلاسمیدهای استخراج شده با استفاده از آنزیم‌های برشی SphI و KpnI انجام گردید. در نهایت برای تائید بیشتر همسانه‌سازی، توالی‌یابی با استفاده از آغازگرهای pJET1.2 F وpJET1.2 R  انجام شد.

در این تحقیق از ناقل ویروسی pZGFP به‌منظور بیان موقت قطعات ژنی هدف در گیاه کدو استفاده شد (Hsu et al., 2004). به‌منظور همسانه‌سازی قطعات ژنی هدف در ناقل ویروسی، ناقل‌های همسانه‌سازی نوترکیب به‌همراه ناقل ویروسی pZGFP مورد هضم با آنزیم‌های برشی SphI و KpnI قرار گرفتند. پس از جداسازی محصولات حاصل از هضم روی ژل آگارز، قطعات مربوط به ژن هدف و ناقل ویروسی با استفاده از کیت Expin Gel SV (GeneAll، کره جنوبی) خالص‌سازی شدند. سپس محصول واکنش اتصال به روش قبلی به سلول‌های مستعد E. coli سویه DH5α وارد شد. تائید همسانه‌سازی ژن هدف در ناقل ویروسی با استفاده از آزمون کلنی PCR با آغازگرهای اختصاصی قطعات ژنی هدف (جدول1) و واکنش هضم آنزیمی با آنزیم‌های برشی SphI و KpnI انجام شد. ناقل‌های ویروسی حاصل pZNb42I و pZNb42II نامیده شدند.

ناقل‌های ویروسی نوترکیب با استفاده از کیت تخلیص پلاسمید و بر اساس دستورالعمل شرکت سازنده (GenaAll، کره) استخراج و پس از خراش‌دهی برگ موردنظر با استفاده از پودر کربوراندوم، به‌صورت مکانیکی و با استفاده از یک گوش پاک کن روی برگ گیاه کدو مالیده شدند. برای مایه‌کوبی هر گیاه، مقدار 10 میکروگرم از پلاسمیدهای استخراجی استفاده گردید. گیاه مایه‌کوبی شده با بافر به‌عنوان شاهد یا کنترل منفی (Mock) در نظر گرفته شد. به‌منظور انجام بررسی بیان ژن هدف، نمونه‌برداری از برگ گیاهان مایه‌کوبی شده و شاهد 14 روز پس از مایه‌کوبی انجام پذیرفت.

استخراج RNA کل از برگ گیاهان مایه‌کوبی شده و شاهد با استفاده از کیت Ribospin Plant و مطابق با دستورالعمل شرکت سازنده (GeneAll، کره) انجام گرفت. سپس کیفیت RNA استخراج شده با استفاده از ژل آگارز 1% بررسی شد. پس از تیمار با آنزیم DNase I، ساخت cDNA مطابق با دستورالعمل کیت مربوطه صورت گرفت (GeneAll، کره). سپس واکنش RT-PCR با cDNA ساخته شده از قطعه ژنی Nb42I و آغازگرهای اختصاصی  NbF1و NbR1 (جدول 1) و همچنین با cDNA ساخته شده از قطعه‌ی ژنی Nb42II با آغازگرهای اختصاصی  NbF2و  NbR2(جدول 1) انجام گرفت.

به‌منظور استخراج پروتئین، 200 میلی‌گرم بافت برگی از گیاهان مایه‌کوبی شده و شاهد با ازت مایع سائیده شده و در یک میلی‌لیتر از بافر استخراج پروتئین (50 میلی‌مولار تریس، 2 میلی‌مولار EDTA [11]، 04/0 % مرکاپتواتانول و 1 میلی‌مولار بازدارنده پروتئاز PMSF، سیگما-آلدریچ) مخلوط گردید. سپس مخلوط حاصل به‌مدت 10 دقیقه در 4 درجه سانتی‌گراد ورتکس گردید. در مرحله بعد سانتریفوژ در g15000، دمای 4 درجه سانتی‌گراد و به‌مدت 20 دقیقه انجام گرفت. فاز روئی که حاوی پروتئین بود به میکروتیوب جدید انتقال داده شد و در دمای 80- درجه سانتی‌گراد نگه‌داری گردید. غلظت پروتئین محلول کل در مقایسه با پروتئین سرم آلبومین گاوی[12] (BSA) به‌عنوان استاندارد تخمین زده شد (Bradford, 1976).

آزمون SDS-PAGE برای تفکیک پروتئین‎ها با الکتروفورز روی ژل اکریلامید 5/12% انجام شد (Laemmli, 1970). بدین منظور، نمونه‌های پروتئینی به‌همراه بافر نمونه‌گذاری X5 (2 میلی‌مولار تریس (8/6pH )، 50% گلیسرول، 10%SDS ، 1/0% بروموفنول بلو و 05/0% مرکاپتواتانول) به‌مدت 5 دقیقه در دمای 95 درجه سانتی‌گراد جوشانده شد و سپس درون چاهک‌های ژل بارگذاری شدند. الکتروفورز نمونه‌ها به‌مدت 4 ساعت در ولتاژ 100 صورت پذیرفت. پس از اتمام الکتروفورز، ابتدا رنگ‌آمیزی با کوماسی بلو 250-G[13] (Bradford, 1976) و سپس رنگ‌بری مناسب صورت پذیرفت و عکسبرداری از آن انجام گرفت.

بررسی گیاهان هدف در سطح پروتئین به روش لکه‌گذاری نقطه‌ای (Dot blotting) به روش Huang و همکاران انجام شد (Huang et al., 2006). ابتدا پروتئین‌های استخراج شده به‌صورت نقطه‌ای روی غشاء PVDF (GE Healthcare، امرشام، شماره کاتالوگ 10600023) تیمار شده با متانول بارگذاری شد. پس از خشک ‌شدن غشاء در دمای اتاق، بلوکه کردن نواحی غیر اختصاصی آن با استفاده از بافر بلوکه‌ کننده (BSA 1%) انجام شد. سپس مراحل شستشوی غشاء با محلول PBS-T و انکوبه شدن با آنتی‌بادی اولیه polyclonal rabbit anti-camel IgGs (تهیه شده توسط دکتر بهدانی، انستیتوپاستور ایران) صورت پذیرفت. پس از شستشوی مجدد غشاء با محلول PBS-T، آنتی‌بادی ثانویه (Goat anti-rabbit IgG-HRP, Sigma) به غشاء اضافه شد. در پایان، غشاء پس از شست شو با محلول PBS-T به محلول رنگ‌آمیزی (سوبسترای [14]DAB 1%) انتقال یافت و بلافاصله پس از ظهور لکه‌های رنگی غشاء با آب مقطر شستشو داده شد.

بررسی گیاهان هدف در سطح پروتئین به روش لکه‌گذاری وسترن ((Western-blotting انجام شد. پس از جداسازی پروتئین‌ها با روش SDS-PAGE، ابتدا ژل، غشاء PVDF و کاغذ واتمن در بافر انتقال (48 میلی‌مولار تریس (3/8 pH)، 39 میلی‌مولار گلیسین، 3/1 میلی‌مولار SDS و 20% متانول) قرار داده شدند. برای انتقال پروتئین‌ها از ژل به غشاء، از دستگاه Trans-Blot semi-dry (BioRad، امریکا) و دستورالعمل شرکت سازنده استفاده گردید. در مرحله بعد غشاء PVDF به‌مدت 5 ساعت در بافر بلوکه کننده (شیر خشک بدون چربی 5% (PBS-T قرار گرفت. بقیه‌ی مراحل مشابه با آزمون لکه‌گذاری نقطه‌ای انجام شد.

کمی سازی بیان پروتئین در گیاهان هدف با استفاده از روش الایزا (ELISA) به روش غیر مستقیم انجام شد (Engvall & Perlmann, 1971) و هدف از انجام آن تعیین میزان کمی پروتئین موردنظر بود. به این صورت که ابتدا، نمونه‌های پروتئینی موردنظر به‌همراه بافر پوشش‌دهنده[15] در سه تکرار درون چاهک‌های پلیت بارگذاری شدند. سپس مراحل شستشو با محلول PBS-T و بلوکه کردن چاهک‌ها با محلول BSA 1% انجام شد. بعد از شستشوی مجدد با محلول PBS-T، انکوبه شدن با آنتی‌بادی اولیه صورت پذیرفت. در نهایت پس از افزودن آنتی‌بادی ثانویه، محلول سوبسترای[16]TMB  به هر چاهک افزوده شد و بعد از توقف واکنش آنزیمی با اسید سولفوریک 1 مولار، میزان جذب در طول موج 450 نانومتر با استفاده از دستگاهMicroplate reader  (BioTek، امریکا) خوانده شد.

نتایج

پس از همسانه‌سازی قطعات ژنی هدف در ناقل همسانه‌سازی pJET، آزمون کلنی PCR با کلنی‌های رشد یافته روی محیط انتخابی حاوی آنتی‌بیوتیک انجام شد و مشاهده قطعات تکثیر شده (قطعه 524 جفت بازی برای ژن‌های Nb42I و Nb42II) با استفاده از آغازگرهای ناقل pJET (جدول 1)، درج ژن‌های هدف را در ناقل مذکور تائید نمود (شکل 1- الف و ج). هضم آنزیمی ناقل استخراج شده از یک کلنی مثبت (از هر یک از ناقل‌های نوترکیب) با آنزیم‌های SphI و KpnI نیز همسانه‌سازی ژن‌های هدف را تائید کرد (شکل 1- ب و د). همچنین نتایج حاصل از توالی‌یابی، صحت توالی درج شده در ناقل pJET را تائید نمود. به‌منظور همسانه‌سازی قطعات ژنی هدف در ناقل ویروسی pZGFP، واکنش هضم آنزیمی ناقل‌های همسانه‌سازی نوترکیب و نیز ناقلpZGFP  با آنزیم‌های برشی SphI و KpnI انجام گرفت. پس از تخلیص قطعات‌ ژنی و ناقل از روی ژل، واکنش اتصال بین قطعات ژنی هدف و ناقل انجام شد. آزمون‌ کلنی PCR با استفاده از آغازگرهای اختصاصی ژن نانوبادی (جدول 1) و هضم آنزیمی، همسانه شدن قطعات ژنی Nb42I (شکل 2- الف و ب) و Nb42II (شکل 2- ج و د) را به جای ژن GFP در ناقل ویروسی pZGFP تائید نمودند. تکثیر قطعه‌ی 398 جفت بازی در نتیجه آزمون RT-PCR با استفاده از آغازگرهای اختصاصی ژن نانوبادی (جدول 1) در گیاهان مایه‌کوبی شده و نیز عدم تکثیر آن در گیاه شاهد و کنترل منفی (RNA تیمار شده با DNaseI) بیانگر بیان موفق از هر دو قطعه‌ی ژنی هدف در گیاهان مایه‌کوبی شده با ناقل‌های نوترکیب در سطح رونویسی بود (شکل 3).

شکل 1- الف) آشکارسازی محصول کلنی PCR ژن Nb42I روی ژل آگارز 1%: چاهک‌های 1 تا 8- کلنی‌های رشد یافته روی محیط ب) هضم آنزیمی ناقل pJETNb42I روی ژل آگارز 1%: چاهک 1- ناقل برش نیافته، چاهک 2- ناقل برش یافته ج) آشکارسازی محصول کلنی PCR ژن Nb42II روی ژل آگارز 1%: چاهک‌های 1 تا 10- کلنی‌های رشد یافته روی محیط د) هضم آنزیمی ناقل pJETNb42II روی ژل آگارز 1%: چاهک 1- ناقل برش نیافته، چاهک 2- ناقل برش یافته، M- نشانگر مولکولی Kb1، C^-- کنترل منفی (بدون DNA الگو).

Figure 1- Detection of colony PCR product of Nb42I gene on the 1% agarose gel: lanes 1-8- colonies grown on the medium b) Enzyme digestion of pJETNb42I vector on the 1% agarose gel: lane 1- undigested vector, lane 2- digested vector c) Detection of colony PCR product of Nb42II gene on the 1% agarose gel: lanes 1-10- colonies grown on the medium d) Enzyme digestion of pJETNb42II vector on the 1% agarose gel: lane 1- undigested vector, lane 2- digested vector, M- 1Kb molecular marker, C^-- negative control (without template DNA).

شکل 2- الف) آشکارسازی محصول کلنی PCR ژن Nb42I روی ژل آگارز 1%: چاهک‌های 1 تا 7- کلنی‌های رشد یافته روی محیط، C⁺- ناقل pHEN6c-Nb42 ب) هضم آنزیمی ناقل pZNb42I روی ژل آگارز 1%: چاهک 1- ناقل برش نیافته، چاهک 2- ناقل برش یافته ج) آشکارسازی محصول کلنی PCR ژن Nb42II روی ژل آگارز 1%: چاهک‌های 1 تا 9- کلنی‌های رشد یافته روی محیط، C⁺- ناقل pUC57-Nb42HFBI د) هضم آنزیمی ناقل pZNb42II روی ژل آگارز 1%: چاهک 1- ناقل برش نیافته، چاهک 2- ناقل برش یافته، M- نشانگر مولکولی Kb1، C^-- کنترل منفی (بدون DNA الگو).

 Figure 2- Detection of colony PCR product of Nb42I gene on the 1% agarose gel: lanes 1-7- colonies grown on the medium, C⁺- pHEN6c-Nb42 vector b) Enzyme digestion of pZNb42I vector on the 1% agarose gel: lane 1- undigested vector, lane 2- digested vector c) Detection of colony PCR product of Nb42II gene on the 1% agarose gel: lanes 1-10- colonies grown on the medium, C⁺- pUC57-Nb42HFBI vector d) Enzyme digestion of pZNb42II vector on the 1% agarose gel: lane 1- undigested vector, lane 2- digested vector, M- 1Kb molecular marker, C^-- negative control (without template DNA).

هدف از مایه‌کوبی برگ‌های گیاهان در این تحقیق، بیان موقت پروتئین نوترکیب نانوبادی Nb42 می‌باشد. اگرچه با بررسی‌هایی که در سطح RNA انجام شد، بیان این ژن در برگ‌های مایه‌کوبی شده تائید گردید؛ اما درج ژن لزوما به‌معنی تولید پروتئین نوترکیب نیست، بنابراین لازم است پروتئین هدف ردیابی گردد و مقدار تولیدی پروتئین هدف مشخص گردد.

شکل 3- الف) آشکارسازی RNA استخراج شده و محصول RT-PCR ژنNb42I  روی ژل آگارز 1%.: چاهک 1- RNA گیاه شاهد، چاهک ‏2- RNA گیاه مایه‌کوبی شده با ناقل pZNb42I، چاهک‏های 3 تا 7- گیاهان مایه‌کوبی شده با ناقلpZNb42I ، C⁺- کنترل مثبت (ناقل pZNb42I) ب) آشکارسازی  RNA استخراج شده و محصول RT-PCR ژنNb42II  روی ژل آگارز 1%.: چاهک 1- RNA گیاه شاهد، چاهک ‏2- RNA گیاه مایه‌کوبی شده با ناقل pZNb42II، چاهک‏های 3 تا 7- گیاهان مایه‌کوبی شده با ناقلpZNb42II ، C⁺- کنترل مثبت (ناقل pZNb42II)، M- نشانگر مولکولی Kb1، C^-₁تا C^-_3- کنترل‏های منفی (آب، RNA و گیاه شاهد) می‌باشند.

Figure 3- a) Detection of extracted RNA and of RT-PCR product of Nb42I gene on the 1% agarose gel: lane 1- control plant RNA, lane 2- inoculated plant RNA with pZNb42I, lane 3-7- inoculated plants with pZNb42I vector, C⁺-positive control(pZNb42I vector) b) Detection of extracted RNA and of RT-PCR product of Nb42II gene on the 1% agarose gel: lane1- control plant RNA, lane 2- inoculated plant RNA with pZNb42II, lane 3-7- inoculated plants with pZNb42II vector, C⁺-positive control(pZNb42II vector), M- 1Kb molecular marker, C^-₁- C^-₃- negative controls (water, RNA, and control plant).

                        
جدول 1- آغازگرهای اختصاصی طراحی شده برای تکثیر و تایید درج ژن هدف در ناقل pJET.

Table 1- Specific primers designed for the amplification and confirmation of the target gene insertion into the pJET vector.

نتایج آزمون لکه‌گذاری نقطه‌ای حضور پروتئین نوترکیب Nb42I را در عصاره پروتئینی استخراج شده از برگ گیاهان مایه‌کوبی شده با ناقل pZNb42I در مقایسه با گیاه شاهد (گیاه مایه‌کوبی شده با بافر) (شکل 4- الف) و همچنین حضور پروتئین نوترکیب Nb42II را در عصاره پروتئینی استخراج شده از برگ گیاهان مایه‌کوبی شده با ناقل pZNb42II در مقایسه با گیاه شاهد نشان داد (شکل 4- ب). این نتایج بیانگر بیان موفق پروتئین‌های نوترکیب Nb42I و Nb42II در گیاهان مایه‌زنی شده با ناقل‌های هدف بود. پس از انجام آزمون SDS-PAGE، مقایسه الگوی باندی گیاهان مایه‌کوبی شده و شاهد تفاوت باندی قابل تشخیصی را در محدوده‌ی مورد انتظار برای قطعات ژنی هدف نشان نداد. لذا به‌منظور بررسی بیشتر بیان پروتئین نوترکیب از آزمون لکه‌گذاری وسترن استفاده گردید. آزمون لکه‌گذاری وسترن با آنتی‌بادی اختصاصی نانوبادی (polyclonal rabbit anti-camel IgG) روی پروتئین‌های استخراج شده از گیاهان مایه‌کوبی شده، حضور یک باند مشخص را در محدوده‌ی موردانتظار ( kDa17-11) برای قطعات ژنی Nb42I و Nb42II در مقایسه با باند 15 کیلودالتون پروتئین نانوبادی Nb42 به‌عنوان کنترل مثبت نشان داد. هیچ گونه باند مشابهی در مورد پروتئین استخراج شده از گیاه شاهد مشاهده نشد (شکل 5).

شکل 4- الف) آزمون لکه‌گذاری نقطه‌ای گیاهان مایه‌کوبی شده با ناقل  pZNb42Iو گیاه شاهد: لکه‏های 1 تا 7- نمونه‏های پروتئینی گیاهان بیان‏کننده Nb42I ب) آزمون لکه‌گذاری نقطه‌ای گیاهان مایه‌کوبی شده با ناقلpZNb42II  و شاهد: لکه‏های 1 تا 6 - نمونه‏های پروتئینی گیاهان بیان‏کننده Nb42II، C⁺- کنترل مثبت (پروتئین Nb42 خالص شده از باکتری)،  C^-- کنترل منفی (نمونه پروتئینی گیاه شاهد).

Figure 4- a) Dot blot analysis of inoculated plants with pZNb42I vector and control plant: spots 1-7- protein samples of plants expressing Nb42I b) Dot blot analysis of inoculated plants with pZNb42II vector and control plant: spots 1-6- protein samples of plants expressing Nb42II, C⁺- positive control, bacterial purified Nb42 protein, C^-- negative control (protein sample of control plant).

در نهایت، جهت برآورد کمی پروتئین نوترکیب تولید شده در گیاهان مایه‌کوبی شده از آزمون الایزا استفاده شد. این آزمون تفاوت معنی‌داری بین میزان جذب نوری پروتئین گیاهان مایه‌کوبی‌شده و شاهد برای قطعات ژنی مختلف نشان داد. همانطور که در شکل 6 مشاهده می‌شود برای پروتئین نوترکیب Nb42I گیاه شماره 1 و برای پروتئین نوترکیب Nb42II گیاه شماره 5 بیشترین تفاوت میزان جذب را نسبت به گیاه شاهد نشان دادند (شکل 6- الف و ج).

این گیاهان با بیشترین میزان جذب به ترتیب حاوی 2 و 8/6 میکروگرم پروتئین نوترکیب در گرم بافت برگی می‌باشند (شکل 6 – ب و د). به‌منظور به دست آوردن میزان بیان، میانگین داده‌های جذب خوانده شده برای هر گیاه با دستگاه ELISA Reader، در معادله رگرسیونی به دست آمده با استفاده از غلظت‌های مشخص پروتئین کنترل مثبت (نانوبادی بیان شده در باکتری) قرار داده شد و میزان پروتئین بیان شده در برگ گیاهان هدف تعیین گردید.

شکل 5- الف) آزمون  لکه‌گذاری وسترن برای تایید بیان پروتئین نوترکیب Nb42I: چاهک‌های 1 تا 3- گیاهان کدو حاوی پروتئین نوترکیب Nb42I ب) آزمون لکه‌گذاری وسترن برای تایید بیان پروتئین نوترکیب Nb42II: چاهک‌های 1 تا 3- گیاهان کدو حاوی پروتئین نوترکیب Nb42II، C⁺- کنترل مثبت (پروتئین Nb42 خالص شده از باکتری)، M- نشانگر پروتئینی (سیناژن)، C^-- کنترل منفی (گیاه شاهد).

Figure 5- a) Western blot analysis for confirmation of Nb42I recombinant protein expression: lanes 1-3- cucurbit plants containing the Nb42I recombinant protein b) Western blot analysis for confirmation of Nb42II recombinant protein expression: lanes 1-3- cucurbit plants containing the Nb42II recombinant protein, C⁺- positive control (bacterial purified Nb42 protein), M- protein marker (cinnagen), C^--negative control (control plant).

بحث و نتیجه‌گیری

زراعت مولکولی و تولید پروتئین‌های نوترکیب در ایران با موفقیت‌های ارزشمندی همراه بوده است. تولید پروتئین‎ها‌ی داروئی مهم از قبیل اینترفرون گاما (Bagheri et al., 2013)، انسولین (Yarbakht et al., 2015)، فعال کننده‌ی پلاسمینوژن بافتی (Abdoli-Nasab et al., 2013)، نانوبادی علیه گیرنده فاکتور رشد سلول‌های عروق خونی[17] (Mirzaee et al., 2017) و غیره توسط تیم تحقیقاتی دکتر جلالی در آزمایشگاه بیوتکنولوژی دانشکده کشاورزی دانشگاه تربیت مدرس، نمونه‌هایی از این موفقیت‌ها می‌باشند. برای گیاهان تراریخته نسل سوم با هدف تولید پروتئین‌های مورد استفاده داروئی و صنعتی، چالش اصلی دسترسی به سطح بالای بیان پروتئین می‌باشد.

شکل 6- الف) نمودار آزمون الایزا برای گیاهان کدو ‌بیان کننده پروتئین‎ نوترکیب Nb42I در مقایسه با گیاه شاهد. ستون‌های 1 تا 6- گیاهان مایه‌کوبی شده با ناقل ویروسی نوترکیب pZNb42I، ستون 7- گیاه شاهد ب) میزان تجمع پروتئین نوترکیب Nb42I در هر گرم بافت برگی گیاهان کدو: ستون‌های 1 تا 6- گیاهان کدو ‌بیان کننده پروتئین نوترکیب ج) نمودار آزمون الایزا برای گیاهان کدو ‌بیان کننده پروتئین‎ نوترکیب Nb42II در مقایسه با گیاه شاهد. ستون‌های 1 تا 6- گیاهان مایه‌کوبی شده با ناقل ویروسی نوترکیب pZNb42II، ستون 7- گیاه شاهد د) میزان تجمع پروتئین نوترکیب Nb42II در هر گرم بافت برگی گیاهان کدو: ستون‌های 1 تا 6- گیاهان کدو ‌بیان کننده پروتئین نوترکیب.

Figure 6- a) ELISA chart for cucurbit plants expressing the Nb42I recombinant protein compared with control plant: columns 1-6- inoculated plants with pZNb42I recombinant viral vector, column 7- control plant b) The amount of Nb42I recombinant protein accumulation per gram of leaf tissue from cucurbit plants: columns 1-6- cucurbit plants expressing the recombinant protein c) ELISA chart for cucurbit plants expressing the Nb42II recombinant protein compared with control plant: columns 1-6- inoculated plants with pZNb42II recombinant viral vector, column 7- control plant d) The amount of Nb42II recombinant protein accumulation per gram of leaf tissue from cucurbit plants: columns 1-6- cucurbit plants expressing the recombinant protein.

رویکردهای مختلفی برای افزایش سطح بیان پروتئین هدف در گیاهان تراریخته پیشنهاد می‌شود از قبیل: انتخاب پیشبرنده مناسب، عناصر افزایش دهنده[18]، بهینه‌سازی کدونی، هدف‎گیری درون ‌سلولی پروتئین نوترکیب، پایداری پروتئین هدف و غیره (Benchabane et al., 2008; Gerasimova et al., 2016; Streatfield 2007; Ullrich et al., 2015). در دهه‌های اخیر نشان داده شده است که یک فاکتور موثر مهم در افزایش سطح بیان پروتئین نوترکیب بهینه‌سازی کدونی است (Webster et al., 2017). به‌طور مثال، توالی نوکلئوتیدی انتهای ′5 توالی ژنP450  مطابق با ترجیح کدونی گیاه میزبان توتون تغییر داده شد و این تغییر منجر به افزایش سطوح خیلی پایین بیان گردید و پروتئین نوترکیب با استفاده از آزمون لکه‌گذاری وسترن قابل شناسایی بود (Batard et al., 2000). به‌طور مشابه هنگامی که توالی نوکلئوتیدی ژن CTB[19] مطابق با ترجیح کدونی گیاه توتون تغییر داده شد، بیان ژن بهینه شده در مقایسه با ژن بهینه نشده 15 برابر افزایش یافت (Kang et al., 2004). همچنین ژنcry6A  با تغییر کدون‌های نادر با کدون‌های هم معنی خود در گیاه گوجه فرنگی بهینه گردید. بیان پروتئین در شکل تغییر نیافته آن قابل تشخیص نبود در حالی‌که ژن تغییر یافته توسط آزمون لکه‌گذاری وسترن شناسایی گردید (Li et al., 2007). بعلاوه، بهینه کردن توالی ژن رمز کننده فاکتور رشد اپیدرمی مطابق با ترجیح کدونی گیاه توتون، منجر به افزایش بیان این پروتئین شده است (Thomas & Walmsley 2014).

در تحقیق حاضر، قطعات مختلف نانوبادی (Nb42I و Nb42II) به‌طور موقت با استفاده از ناقل ویروسی و تحت کنترل پیشبرنده ویروسی قوی S35 ویروس موزائیک کلم گل در گیاه کدو بیان شدند. پس از انجام همسانه‌سازی موفق قطعات مختلف ژنی در ناقل ویروسی، آزمون‌ RT-PCR رونویسی از قطعات مختلف ژنی هدف را تائید نمود. واکنش پروتئین استخراج شده از برگ گیاهان مایه‌کوبی شده نسبت به آنتی‌بادی اختصاصی نانوبادی با استفاده از روش الایزا مورد آزمون قرار گرفت. نتایج آزمون الایزا نشان داد که میزان بیان پروتئین‌های نوترکیب‌ Nb42I و Nb42II به ترتیب 2 و 8/6 میکروگرم پروتئین در هر گرم بافت برگی می‌باشد که در مقایسه با برخی از تحقیقات انجام شده در زمینه‌ی بیان نانوبادی در گیاهان بالاتر بود (Korouzhdehy et al., 2011; Magee et al., 2004). بیان شکل بهینه شده نانوبادی (Nb42I) تقریبا 5/3 برابر شکل بهینه نشده (Nb42II) می‌باشد که در مقایسه با برخی تحقیقات انجام شده در زمینه‌ی بررسی اثر بهینه‌سازی کدونی بیشتر بود (Batard et al., 2000; Li et al., 2007). این افزایش بیان نشان داد که فاکتور بهینه‌سازی کدونی می‌تواند به‌عنوان یک فاکتور موثر برای افزایش بیان پروتئین در نظر گرفته شود.

تاکنون نانوبادی‌های مختلف با سطوح متغییر موفقیت در گیاهان بیان شده‌اند. در مقایسه با سامانه‌ی بیان موقت، هنگامی که نانوبادی‌های شتری در گیاهان تراریخته بیان شدند، در سطوح خیلی کم تجمع یافتند (Korouzhdehy et al., 2011; Magee et al., 2004). به‌طور مثال، به‌منظور کاهش سمیت TNFα[20] بیان نانوبادی علیه آن در گیاه توتون صورت گرفت و تجمع کمتر از 1 درصد پروتئین کل (TSP) برای نانوبادی مذکور گزارش شد (Winichayakul et al., 2009). در سال 2011 نیز Conrad و همکاران نانوبادی علیه TNF را در گیاهان تراریخته توتون بیان نمودند و سطح بیان آن پس از الحاق به دنباله ELP[21] از 003/0 به 7/1 درصد TSP تغییر یافت (Conrad et al., 2011). بعلاوه سطوح بیان کمتر از 1% نیز برای نانوبادی علیه گیرنده فاکتور رشد اندوتلیال عروقی در گیاه کاهو بدست آمده است (Mirzaee et al., 2017).

نمونه‌هایی گیاهی که در آزمون لکه‌گذاری نقطه‌ای و الایزا در تایید یکدیگر بودند با روش لکه‌گذاری وسترن مورد آزمون قرار گرفتند. نتیجه‌ی این آزمون نشان داد که برای قطعات ژنی Nb42I و Nb42II در محدوده‌ی بین باندهای 11 و 17 کیلودالتون باندی مشاهده می‌گردد که در گیاه شاهد وجود ندارد. حضور این باندها بیانگر بیان موفق پروتئین‌های نوترکیب موردنظر بود.

مصرف آنتی‌بادی‌ها با اهداف تشخیصی و درمانی (به‌ویژه برای درمان سرطان) روز به روز در حال افزایش می‌باشد. بنابراین، ایجاد یک سیستم کارا به‌منظور تولید انبوه و ارزان آن‌ها امری ضروری و اجتناب ناپذیر است. فن‏آوری بیان موقت با استفاده از ناقل‌های ویروسی شرایطی را فراهم می‌کند که می‌توان در مدت زمانی اندک بیان آنتی‌بادی را چندین برابر نسبت به گیاهان تراریخته افزایش داد. از طرف دیگر یکی از چالش‎های اصلی که مانع تولید اقتصادی پروتئین‌های نوترکیب در گیاهان تراریخته می‌شود سطوح تجمع ناکافی پروتئین نوترکیب می‌باشد. بهینه کردن توالی رمز کننده ژن مورد نظر مطابق با ترجیح کدونی گیاه میزبان می‌تواند به‌عنوان یک رویکرد مناسب جهت بیان پروتئین در گیاهان در تحقیقات آینده به کار گرفته شود.