نوع مقاله : مقاله پژوهشی
نویسندگان
1 کارشناسی ارشد بیماری شناسی گیاهی دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی ساری، ساری، ایران.
2 دانشیار گروه گیاهپزشکی دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی ساری، ساری، ایران.
3 استاد گروه گیاهپزشکی دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی ساری، ساری، ایران.
چکیده
کلیدواژه‌ها
عنوان مقاله [English]
نویسندگان [English]
Tobacco as a model plant (owing to certain features) is extensively used in molecular research with the aims to understand the fundamental plant and pathogen interactions. Fire blight bacterial disease of tobacco (Pseudomonas syringae pv. tabaci (Pst)) causes considerable damage to tobacco worldwide. Induction of genes associated with virulence that play a role in resistance to diseases can be effective in reducing the severity of disease. The evidence suggests that plant hormones are effective in gene expression in plants and increase the production of secondary metabolites. In addition, they stimulate the immune system of plant through the activation of transcription of genes linked with plant defense mechanisms that regulate the induced resistance. In this study, the expression of PR1, PR5, Pal, Catalase and WRKY12 in tobacco plants treated with salicylic acid at a concentration of 3 mM and tobacco plant treated with jasmonic acid at a concentration of 0.5 mM and also control plant in times 0, 12, 24, 48 and 72 after injection of Pseudomonas syrigae pv. tabaci was investigated by Quantitative Real-time PCR (QRT-PCR) technique. The results showed that jasmonic acid and particularly salicylic acid treatments caused significant changes in the expression of these genes after bacterial injection.
کلیدواژه‌ها [English]
القای بیان چند ژن مرتبط با بیماری‌زایی در گیاه توتون تیمار شده با هورمون‌های اسید سالیسیلیک و جاسمونیک اسید به دنبال آلودگی با باکتری Pseudomonas syringae pv. tabaci
فریده فرج اللهی1*، ولی الله بابایی‌زاد 2، حشمت الله رحیمیان3
1کارشناسی ارشد بیماری شناسی گیاهی دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی ساری، ساری، ایران.
2دانشیار گروه گیاهپزشکی دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی ساری، ساری، ایران.
3استاد گروه گیاهپزشکی دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی ساری، ساری، ایران.
تاریخ دریافت: 11/02/1396، تاریخ پذیرش: 26/04/1396
چکیده
توتون به عنوان گیاهی مدل، امروزه به طور چشمگیری در تحقیقات مولکولی با هدف درک مبانی تعاملات بیمارگر و گیاه استفاده میشود. بیماری باکتریایی آتشک توتون گسترش جهانی دارد و خسارت قابل توجهی به توتون وارد میکند. عامل این بیماری Pseudomonas syringae pv. tabaci (Pst) میباشد. القای ژنهای مرتبط با بیماری‌زایی که در مقاومت به بیماری‌ها ایفای نقش میکنند می‌تواند در کاهش شدت بیماری مؤثر باشد. شواهد نشان میدهد که هورمون‌های گیاهی در بیان این ژن‌ها در گیاهان مؤثر بوده و موجب افزایش تولید متابولیت‌های ثانویه میگردند. علاوه بر این سیستم دفاعی گیاه را از طریق فعالسازی رونویسی ژنهای مرتبط با مکانیسم دفاعی گیاه را تحریک نموده و باعث تنظیم مقاومت القایی میگردند. در این تحقیق، بیان ژنهای PR1، PR5، PAL، Catlase و WRKY12 در گیاه توتون تیمار شده با هورمون اسید سالیسیلیک با غلظت 3 میلیمولار و اسید جاسمونیک با غلظت 5/0 میلیمولار و گیاه شاهد، پس از آلودگی با باکتری Pseudomonas syrigae pv. tabaci در چند بازه زمانی با استفاده از تکنیک Quantitative Real time PCR (QRT-PCR) مورد بررسی قرار گرفت. نتایج نشان داد که تیمار اسید جاسمونیک و به خصوص اسید سالیسیلیک باعث تغییرات قابل توجه در بیان این ژن‌ها پس از تزریق باکتری شده است.
واژه‌های کلیدی: آتشک توتون، اسید سالیسیلیک، اسید جاسمونیک، QRT-PCR، ژنهای مقاومت.
مقدمه
توتون گیاه عالی گلدار، از راسته دو لپه‌ای‌ها، از خانواده Solonaceae و با نام علمی Nicotiana tabacum میباشد. گیاه توتون در چند دهه اخیر به یک سیستم مدل برای اهداف مهندسی ژنتیک تبدیل شده است. امروزه گیاه توتون به عنوان ابزاری برای بدست آوردن دانش بنیادی در بیولوژی گیاهی مبدل شده است. با پیشرفت‌های علم مولکولی گیاهی توتون به عنوان یک کارخانه گیاهی برای اهدافی چون سیستم تولید پروتئینهای نو‌ترکیب، آنزیم‌های صنعتی و آنتی‌بادی‌ها توسعه یافته است (Ganapathi et al., 2004).
بیماری آتشک توتون گسترش جهانی دارد. بیمارگر Pseudomonas syringae pv. tabaci علاوه برتوتون، سویا را هم آلوده میکند. آتشک هم در خزانه و هم در مزرعه خسارت می‌زند. گیاهچه‌های آلوده ممکن است بمیرند. در بوته‌های توتون در مزرعه، لکههای بزرگ، نامنظم و مرده روی برگ ظاهر میشود؛ لکه‌ها و برگهای آلوده می‌ریزند که این پدیده محصول را از نظر تجاری بی‌ارزش میکند (Agrios, 2005).
استراتژی مقاومت به بیماری جزء مهمی از کشاورزی مدرن میباشد که کاربرد مواد شیمیایی را کاهش داده و سبب ایجاد کشاورزی سالم می‌گردد. گیاهان توسط مکانیسم ساختاری و مقاومت القایی از خود در برابر بیمارگرها دفاع میکنند (Sticher et al., 1997; Heil and Bostock, 2002). استفاده از مهندسی ژنتیک یکی از روش‌های کارآمد جهت تولید گیاهان مقاوم به بیمارگرها میباشد (Lillemo et al., 2008; He et al., 2009).
در این میان ژنهای مقاومت به خصوص ژنهای سنتز‌کننده پروتئینهای مرتبط با بیماری‌زایی (PRs) بیشترین توجه را به خود جلب کرده‌اند که میتوان از آنها در تولید گیاهان تراریخت مقاوم به عوامل تنش‌زا استفاده کرد (Kogel and Langen, 2005; Van Loon and Pieterse, 2006). پروتئینهای PR تولید شده توسط این دسته از ژن‌ها، موجب تخریب دیواره‌های سلول قارچی، ایجاد اختلال درغشاهای سلولی آن، تقویت سیستم پاسخ دفاعی میزبان، دخالت در بیماری‌زایی و سنتز پروتئینهای ضد قارچی می‌شوند (Dahleen et al., 2001). بیان این پروتئینها در گیاه در برابر بیمارگر‌های مختلف به صورت اختصاصی انجام میشود (Thomma et al., 1998).
در میان PR پروتئینها، PR1 از مهمترین آنها در مقاومت به بیمارگر‌های مختلف میباشد (Van Loon and Pieterse, 2006). اگرچه عملکرد بیوشیمیایی خاصی برای آن در نظر گرفته نشده اما نقش ضد میکروبی آن توسط محققین گزارش شده است (Rauscher et al., 1999; Sels et al., 2008). این پروتئین بر روی غشا موثر است و احتمالا در ضخیم شدن دیواره سلولی و جلوگیری از گسترش بیمارگر در آپوپلاست نقش دارند. مشخص شده که ژنهای PR1 توتون به واسطه‌ی سیستم سیگنال‌رسانی وابسته به مسیرهای SA، JA و یا اتیلن القا میشود. مسیرهای وابسته به جاسمونیک اسید و یا مسیرهای وابسته به اتیلن در القای بیان بعضی از ژنهای PR1 بازی، نقش دارند. در حالی که مسیر وابسته به SA در القای ژنهای PR1 اسیدی موثر میباشد (Vidhyasekaran, 2002).
پروتئینهای متعلق به خانواده PR5 به دلیل تشابهات توالی آنها با پروتئین گیاهی تائوماتین (Thaumatin) به پروتئینهای شبه تائوماتین (TL)Thaumatin-like معروف هستند (Moralejo et al.,1999). گروه پروتئینهای PR5 تاکنون از توتون، آرابیدوپسیس، برنج، گندم و بسیاری گیاهان دیگر جدا شده‌اند (Vigers et al., 1991). تجمع این پروتئینها در گیاهان در واکنش به موقعیتهای استرسزا مانند غلطت‌های نمک بالا، زخم‌ها یا حمله بیمارگرها دیده شده است. این پروتئینها، نفوذپذیری غشای سلولی بیمارگر را تغییر میدهد (Kitajima and Sato, 1999). فرمهای بازی پروتئینهای PR5 شبیه اسموتین میباشند. اسموتین یک پروتئین القایی است که در اثر تنش شوری در توتون ردیابی شده است. بنابراین فرمهای بازی را اسموتین می‌خوانند. پروتئینهای PR5 خنثی در گیاهان سالم وجود ندارد ولی به وسیله اتیلن القا می‌شوند (Vidhyasekaran, 2002).
با توجه به گزارشاتی مبنی بر دخالت مشتقات مسیر بیوشیمیایی فنیل پروپانوئید در مواجهه با انواع تنشهای زیستی و غیر زیستی (Campbell and Elis, 1992; Xu et al., 2012) میتوان به بررسی تغییرات آنزیم‌های این مسیر از جمله فنیل آلانین آمونیالیاز (PAL) اشاره کرد. ژن PAL از طریق دخالت در مسیرهای سنتز فنیل پروپانوئید‌ها و ایزوفلاونوئید‌ها که فعالیت فیتوآلکسینی دارند در مقاومت گیاه نقش بسیار مهمی ایفا میکند. این ژن در مسیر بیوسنتز اسید سالیسیلیک و دیگر ترکیبات وابسته دفاعی دخیل بوده و یک ترکیب سیگنالدهی کلیدی برای فعالسازی ژنهای وابسته دفاعی، کاتالیز کننده‌ها و فاکتورهای رونویسی است (Stotz et al., 2009).
تغییرات مسیرهای سیگنالدهی ذاتی، ازجمله SAR و ISR، می‌تواند باعث فعال شدن تعدادی از عوامل رونویسی و افزایش بیان تعداد زیادی از ژن دفاعی شود. اشکال اصلی فعالسازی کل مسیرهای سیگنالدهی، کاهش تناسب هزینه و عملکرد بالقوه در ارتباط با بیان ساختاری تعداد زیادی از ژن‌ها است. بنابراین، ژنهایی که بخشی از مسیر را فعال میکنند یا مسیر را تقویت میکنند، نامزد‌های ایده‌آل هستند. ژن نامزد بالقوه برای مهندسی ژنتیک، شامل فاکتورهای رونویسی مانند WRKY، ERF1 و NPR1 میباشد.
خانواده ژنی WRKY نماینده مهمترین گروه عوامل تنظیم کننده رونویسی است (Zhang and Wang, 2005). باند شدن فاکتورهای رونویسی به DNA برای فعالسازی ژنهای PR مهم است (Van Loon and Pieterse , 2006). یکصد نوع ژن WRKY در برنج شناسایی شده است. بیان ژن WRKY12 در برنج در اثر باکتری Xoo موجب افزایش بیان NPR1، PR1b، فنیل آلانین آمونیالیاز (PAL) و پراکسیداز (pox) میشود. افزایش بیان WRKY70 در آرابیدوپسیس باعث مقاومت به باکتری‌های Pseudomonas syringe و Pectobacterium carotovora میشود (Li et al., 2004; Li et al., 2006). پیشنهاد شد که WRKY یک تنظیم کننده رونویسی در آبشارهای سیگنالی وابسته به JA و SA است (Song and Goodman, 2001). نتیجه بیان ژن WRKY در توتون موجب افزایش سطح پاسخ مرگ برنامه‌ریزی شده سلولی و HR میشود (Oh et al., 2008). پیشنهاد شده است که فاکتور فعالسازی رونویسی WRKY12 در توتون با متصل شدن به توالی حفاظت شدهای در پروموتور ژن PR1 به نام WK-boxes (TTTTCCAC)، موجب بیش‌بیانی ژن PR1 میشود(Verk et al., 2010).
اسید سالیسیلیک در برگها و ساختمان‌های زایشی گیاه یافت شده است (Raskin, 1992). سالیسیلیک اسید یک مولکول سیگنال داخلی است که در گیاهان وجود دارد و پس از آلودگی به وسیله بیمارگرها، به طور سیستمیک تجمع پیدا میکند. پروتئین متصل به سالیسیلیک اسید در گیاهان ردیابی و مشخص شده است که یک کاتالاز است. کاتالاز فعالیت آب اکسیژنه (H2O2) را متوقف کرده و سالیسیلیک اسید هم از این فعالیت کاتالاز جلوگیری میکند. افزایش سطوح H2O2 در گیاه، به واسطه مهار آنزیم‌های کاتالاز، در فعال شدن واکنشهای دفاعی نقش دارد (Vidhyasekaran, 2002). اسید سالیسیلیک سیستم دفاعی گیاه را از طریق القای رونویسی گروه مشخصی از ژنهای مرتبط با دفاع و توسعه مقاومت سیستمیک تحریک میکند. مطالعات نشان داد که میزان بیان برخی PR پروتئینها بعد از تیمار گیاهچه‌ها با سالیسیلیک اسید افزایش یافته است (Yang et al., 2013).
جاسمونات‌ها و استرمتیل آنها گروه دیگری از تنظیم کنندگان رشد گیاهان، و از مشتقات اسید لینولینیک محسوب می‌شوند که از طریق مسیر بیوسنتزی اکتادکانوئید سنتز می‌شوند (Schaller, 2001). در آغاز جاسمونات‌ها به خاطر فعالیت بازدارندگی رشدی مورد توجه قرار گرفتند ولی امروزه مشخص شده که این ترکیبات در بیشتر گونه‌های گیاهی وجود داشته و تأثیر آنها درافزایش میزان بیان ژنهای خاص گیاهی در هنگام واکنش به ایجاد زخم مورد توجه قرار گرفته است (Yu et al., 2002). جاسمونات‌ها به عنوان ترکیبات پیام‌رسان کلیدی در فرآیند القا که منجر به تجمع متابولیت‌های ثانویه میشود معرفی شده‌اند (Schmidt and Delaney, 2010).
مطالعات اندکی در زمینه استفاده از هورمون‌های گیاهی به منظور القای بیان ژنهای مرتبط با بیماری‌زایی و ایجاد مقاومت در گیاه صورت گرفته است. بنابراین هدف از این پژوهش، ارزیابی میزان بیان ژنهای PR1، PR5، PAL، Catalase و WRKY12 در سطح RNA تحت تیمار دو هورمون سالیسیلیک اسید و جاسمونیک اسید در گیاه توتون است تا از این طریق درک بهتر مسیر القا و عکس العمل گیاه توتون امکان پذیر گردد.
مواد و روشها
تهیه وکشت باکتری Pseudomonas syringae pv. tabaci
این مطالعه در سال 1394 در دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی ساری انجام شد. در این بررسی از سویه استاندارد باکتری Pseudomonas syringae pv. tabaci از کلکسیون باکتری‌های بیماریزای گیاهی دانشگاه گوتینگن آلمان (GCPB) با شماره کاتالوگ GCPB113 و شماره ثبت 460134043 اهدایی آقای دکتر خدایگان، دانشگاه ولیعصر رفسنجان استفاده شد. باکتری Pst در محیط کشت جامد اختصاصی king B به مدت یک ماه در دمای Co۲۷ قابل نگهداری میباشد.
آزمون بیماری‌زایی
از کشت 24 ساعته باکتری Pst در محلول ۱۰ میلی مولار Mgcl₂ سوسپانسیونی با غلظت ۱۰۸ سلول (CFU) در هر میلی‌لیتر تهیه گردید. حدود ۲۰ میکرولیتر از این سوسپانسیون به وسیله سرنگ مخصوص به فضای میانبرگی برگهای توتون تزریق شد. از محلول 10 میلیمولار MgCl2 نیز برای تزریق در گیاهان شاهد استفاده شد (Klement et al., 1990). جهت تأمین رطوبت و دمای مناسب برای فعالیت باکتری در گیاه، پس از قرار دادن پوشش پلاستیکی، نمونهها در اتاقک رشد (Plant Growth Chamber) در دمای ۲۵ درجه سانتی‌گراد، رطوبت ۷۵ درصد و شرایط نوری ۱۶ ساعت روشنایی و ۸ ساعت تاریکی قرار داده شد. ظهور لکههای آبسوخته در برگها بعد از ۳-۴ روز نشانه مثبت بودن آزمون بیمارییزایی تلقی شد.
تهیه گیاهچه
نشاهای توتون رقم K326 از انستیتو تحقیقات توتون ایران- تیرتاش بهشهر دریافت شد. نشاهای دارای ارتفاع ۵-۷ سانتیمتر و ۴-۵ برگ انتخاب و به گلدان‌های حاوی خاک اتوکلاو شده منتقل شد. گلدان‌ها در اتاقک رشد تحت شرایط دمایی ۲۷ درجه سانتی‌گراد، رطوبت ۷۰ درصد و شرایط نوری ۱۶ ساعت روشنایی و ۸ ساعت تاریکی قرار گرفتند.
تعدادی از گیاهچه‌ها با محلول اسید جاسمونیک با غلظت mM 5/0 اسپری شدند. جهت حل نمودن اسید جاسمونیک ابتدا آن را با اتانول (چهار درصد حجمی) حل نموده سپس با آب مقطر به حجم رسانیده شد (Traw and Bergelson, 2003). همچنین تعدادی گیاهچه با محلول اسید سالیسیلیک با غلظت mM 3 تیمار شدند. جهت حل نمودن اسید سالیسیلیک ابتدا آن را با اتانول (ده درصد حجمی) حل نموده و سپس با آب مقطر به حجم رسانیده شد (Muchembled et al., 2006). گیاهچه‌های تیمار شده با جاسمونیک اسید به مدت 7 روز و گیاهچه‌های تیمار شده با سالیسیلیک اسید به مدت 2 روز زیر پوشش پلاستیکی در ژرمیناتور نگهداری شد. تعدادی گیاهچه هم به عنوان شاهد در نظر گرفته شد.
از کشت 24 ساعته باکتری Pst سوسپانسیونی با cfu/ml107 در محلول ۱۰ میلی مولار Mgcl₂ تهیه شد. جذب نوری سوسپانسیون Pst با این غلطت پس از غلظت سنجی با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر با طول موج ۶۰۰ نانومتر میبایست در حدود ۰۱/۰ تا۰۲/۰ باشد. برای مایهزنی، حدود ۲۰ میکرولیتر از سوسپانسیون حاصله به وسیله سرنگ مخصوص به فضای میانبرگی جوانترین دو برگ هر گیاه تزریق شد. در هر برگ، یک نقطه ما بین رگبرگ‌های اصلی برای تزریق در نظر گرفته شد. جهت فراهم آوردن شرایط مناسب برای فعالیت باکتری در نسوج گیاه، برای بالا بردن سطح رطوبت تا مرز ۸۰ درصد، گیاهان با پوشش پلاستیکی پوشانده و در اتاقک رشد در دمای ۲۵ درجه سانتی‌گراد و دوره نوری ۱۶ ساعت روشنایی و ۸ ساعت تاریکی قرار گرفتند. پوشش پلاستیکی ۱۲ ساعت پس از مایهزنی برداشته شد. نمونه‌برداری از بافت برگی گیاهچه‌های تیمار شده و شاهد در فاصله زمانی ۰، ۱۲، 24، ۴۸ و ۷۲ پس از آلودگی انجام گرفت و در فریزر با دمای Co70- نگهداری شدند.
استخراج RNA و زدودن DNA ژنومی از نمونهها
برای استخراج RNA از نمونههای نگهداری شده در فریزر Co70- از بافر TRIZOL (شرکت Invitrogen) استفاده شد. به منظور زدودن DNA ژنومی از نمونههای RNA، از کیت RQ1 RNase-free DNase ساخت شرکت Fermentas استفاده شد. کمیت و کیفیت RNA، با استفاده از ژل آگارز و اسپکتوفتومتر ارزیابی گردید.
ساخت و بررسی کیفیت cDNA
سنتز cDNA با استفاده از AccuPowerR CycleScript RT PreMix (dN6) kit انجام شد. نمونهها تا زمان استفاده در 20- درجه سانتی‌گراد نگهداری شد. جهت بررسی کیفیت نمونههای cDNA سنتز شده از PCR با آغازگر اختصاصی Actin استفاده گردید.
بررسی میزان بیان ژن‌ها به کمک روش Quantitative Real- time PCR
بیان ژن با تکنیک Quantitative real- time PCR انجام شد. برای این منظور از دستگاه Applied Biosystems® StepOnePlus™ Real-Time PCR استفاده شد. در این واکنش از کیت Maxima SYBR Green/ROX qPCR Master Mix (2X) شرکت Thermo استفاده شد.
به منظور بررسی بیان ژن ازآغازگر اختصاصی پیشرو و برگشتی ژن Actin به عنوان کنترل داخلی (Housekeeping) و همچنین آغازگر پیشرو و برگشتی ژن PR1، PR5، PAL، Catalase و WRKY12 برای تکثیر cDNA در RT-PCR استفاده شد (Schmidt and Delaney, 2010).
هر واکنش PCR در حجم نهایی 15 میکرولیتر حاوی یک میکرولیتر cDNA الگو، 8 میکرولیتر مخلوط سایبرگرین، 1 میکرولیتر از هر آغازگر و 4 میکرولیتر آب عاری از Nuclease انجام گرفت. واکنش زنجیره‌ای پلیمراز شامل مرحله واسرشت اولیه با دمای 95 درجه سانتی گراد به مدت 10 دقیقه، سپس 40 چرخه شامل دمای 95 درجه سانتی‌گراد به مدت 15 ثانیه، دمای 60 درجه سانتی‌گراد به مدت 1 دقیقه برای اتصال آغارگر‌ها، سپس رسم منحنی ذوب با دمای 95 درجه سانتی‌گراد به مدت 15 ثانیه، 60 درجه سانتی‌گراد به مدت 1 دقیقه و افزایش دمای 1 درجه سانتی‌گراد در هر چرخه تا دمای 95 درجه سانتی‌گراد و نگهداری در این دما به مدت 15 ثاتیه انجام شد. مقدار تکثیر در انتهای هر چرخه توسط دستگاه اندازه‌گیری شد. سپس تغییرات نسبی بیان ژنهای مورد بررسی نسبت به ژن اکتین نرمالیزه شد. در نهایت محاسبه و تغییرات بیان ژن نیز مطابق با فرمول (ΔΔCT)– 2 اندازه‌گیری شد (Livak and Schmittgen, 2001).
ΔCT) نمونه‌کنترلΔCT- نمونه آزمایش (=ΔΔCT
CT) ژن خانه‌دار CT - ژن هدف (= Δ CT
نتایج و بحث
در این تحقیق الگوی بیان چند ژن در گیاه توتون، در طی 5 بازه زمانی پس از آلودگی به باکتری Pst در سه تیمار سالیسیلیک اسید، جاسمونیک اسید و شاهد مورد بررسی قرار گرفت. نتایج Real time PCR تأیید کرد که سطح بیان ژنهای PR1، PR5، PAL و WRKY12 در هر سه تیمار سالیسیلیک اسید، جاسمونیک اسید و شاهد بعد از آلودگی افزایش و سطح بیان ژن Catalase کاهش پیدا کرد. بررسی روند تغییرات بیان این ژن نشان میدهد که سطح تظاهر این ژن‌ها در زمانهای مختلف پس از آلودگی در این سه تیمار متفاوت میباشد. در گیاه شاهد میزان بیان ژن PR1b در پاسخ به آلودگی باکتریایی از ساعت 12 پس از مایهزنی افزایش اندکی داشت و تا 48 ساعت پس از آلودگی نیز این افزایش بیان ادامه داشت. نرخ بیان این ژن در زمان اوج حدود 1/14 برابر نسبت به زمان صفر افزایش داشت. سپس نرخ بیان 72 ساعت پس از مایهزنی به کمترین میزان بیان خود رسید. در گیاهان تیمار شده با هورمون سالیسیلیک اسید میزان بیان این ژن در پاسخ به آلودگی باکتریایی 12 ساعت پس از مایهزنی جهش قابل توجهی داشت (1/65 برابر افزایش نسبت به زمان صفر). پس از آن نیز بیان این ژن تا 48 ساعت پس از آلودگی به افزایش خود ادامه داد و بیشینه بیان این ژن نیز در همین ساعت مشاهده شد ( 39/95 برابر افزایش نسبت به زمان صفر). نرخ بیان این ژن پس از زمان اوج کاهش یافت و در ساعت 72 پس از مایهزنی به کمترین میزان بیان خود یعنی در حدود 3/20 برابر بیشتر از بیان این ژن در زمان صفر رسیده است.
در گیاهان تیمار شده با جاسمونیک اسید نیز میزان بیان این ژن در پاسخ به آلودگی باکتریایی 12 ساعت پس از مایهزنی شروع به افزایش کرد و بیان آن نیز تا 48 ساعت پس از آلودگی به افزایش خود ادامه داد و بیشینه بیان نیز در همین ساعت مشاهده شد (حدود 9/28برابر افزایش نسبت به زمان صفر). نرخ بیان این ژن پس از زمان اوج کاهش یافت و در ساعت 72 پس از مایه زنی به کمترین میزان بیان خود یعنی در حدود 2/3 برابر بیشتر از بیان این ژن در زمان صفر رسید. نرخ بیان این ژن در گیاهان تیمار شده با جاسمونیک اسید در زمان اوج بیان (48 ساعت پس از مایه زنی) 6/1 برابر بیشتر از بیان این ژن در گیاهان شاهد در بازه زمانی فوق میباشد (شکل 1).
شکل 1- الگوی بیان ژن PR1b در گیاه شاهد، تیمار شده با سالیسیلیک اسید و جاسمونیک اسید در زمانهای مختلف پس از آلودگی با باکتری Pst.
Figure 1- PR1b pattern of gene expression in control plants, treated with salicylic acid, jasmonic acid in various times after infection with Pst.
پروتئین PR1 در بافت‌های مختلف گیاهی مثل دیواره سلولی، دستجات آوندی و واکوئل‌ها وجود دارد (Hoegen et al., 2002; Grunwald et al., 2003). PR1 ها، به عنوان شاخصی برای مقاومت القایی سیستمیک (SAR) شناخته شدند (Schulthesis et al., 2003). نقش ژن PR1 در دفاع توتون علیه باکتری Pst به خوبی ثابت شده است (Block et al., 2005). در این بررسی بیان ژن PR1b در همان ساعتهای اولیه پس از آلودگی (12ساعت پس از آلودگی) افزایش یافت، که طبق آنالیز شیره استخراج شده از آوند آبکش ناحیه دمبرگِ گیاهان مایهکوبی شده با سوسپانسیون باکتری، مشخص شد که اولین افزایش تجمع اسید سالیسیلیک در 12 ساعت پس از تلقیح باکتری صورت میگیرد (Rasmussen et al., 1991). این افزایش بیان در هر سه تیمار تا زمان 48 ادامه یافت. بالا بودن بیان ژن PR1b هم در گیاهان شاهد و هم در گیاهان تیمار شده با هورمون‌های سالیسیلیک اسید و جاسمونیک اسید نشان‌دهنده القای این ژن در تعامل باکتری Pst با توتون است. تجمع نسخههای این ژن 72 ساعت پس از مایهزنی در هر سه تیمار سیر نزولی را طی نمود که احتمالا به دلیل کم شدن تحریک باکتری در گیاهان تیمار شده و مستقر شدن پاتوژن در گیاه و کارآمد نبودن بیان بیشتر این ژن در گیاه شاهد میباشد. میزان بیان این ژن در گیاهان تیمار شده با سالیسیلیک اسید در تمامی بازه‌های زمانی بعد از آلودگی به طور معنی‌داری بیشتر از گیاهان شاهد بود. این افزایش را میتوان به این صورت توجیه کردکه تیمار سالیسیلیک باعث افزایش مولکول سیگنال اسید سالیسیلیک میشود که سبب فعال شدن ژن NPR1 و به دنبال آن افزایش بیان ژن PR1 و القای مکانیسم SAR در گیاه میشود (Shah and Klessing, 1999; Rate 2001). بنابراین گیاه با افزایش بیان این ژن در زمان 48 سبب ایجاد مرگ سلولی برنامه ریزی شده می شود تا از توسعه بیمارگر در سلول میزبان جلوگیری کند و بدین صورت موجب مقاومت گیاه شود. نتایج بررسی‌های دیگر محققین نیز بیانگر افزایش بیان این ژن پس از آلودگی در گیاهان بود (Yang et al., 2013).
از طرفی با توجه به افزایش بیان ژن PR1b در 12 ساعت پس از آلودگی و شناخته شدن آن به عنوان یک مارکر مقاومت القایی تحریک شده توسط SA (Ingrid et al., 2005) و همچنین با توجه به یافته‌های محققین مبنی بر این که SA غالباً در دفاع گیاهان در مقابل پاتوژنهای بیوتروف موثر واقع می‌گردد (Glazebrook, 2005)، میتوان نتیجه گرفت که Pst در تعامل با توتون، مشابه ارگانیسم‌های همیبیوتروف رفتار نموده و توتون در ابتدا با فعال نمودن مسیرهای دفاعی وابسته به SA به حمله این پاتوژن عکسالعمل نشان میدهد.
در گیاهان شاهد میزان بیان PR5 در پاسخ به آلودگی باکتریایی 12 ساعت پس از مایهزنی جهش قابل توجهی داشت (در حدود 3 برابر افزایش نسبت به زمان صفر). پس از آن نیز بیان این ژن تا 24 ساعت پس از آلودگی به افزایش خود ادامه داد و بیشینه بیان این ژن نیز در همین ساعت مشاهده شد (حدود 4/11 برابر افزایش نسبت به زمان صفر). نرخ بیان این ژن پس از زمان اوج کاهش یافت و در ساعت 72 پس از مایهزنی به کمترین میزان بیان خود یعنی حدود 8/5 برابر بیشتر از بیان این ژن در زمان صفر رسیده است.
در گیاهان تیمار شده با هورمون سالیسیلیک اسید میزان بیان این ژن در پاسخ به آلودگی باکتریایی 12 ساعت پس از مایهزنی جهش قابل توجهی داشت (4/8 برابر افزایش نسبت به زمان صفر). پس از آن نیز بیان این ژن تا 24 ساعت پس از آلودگی به افزایش خود ادامه داد و بیشینه بیان این ژن نیز در همین ساعت مشاهده شد ( 6/139 برابر افزایش نسبت به زمان صفر). نرخ بیان این ژن پس از زمان اوج کاهش یافت و در ساعت 72 پس از مایهزنی به کمترین میزان بیان خود یعنی در حدود 3/2 برابر بیشتر از بیان این ژن در زمان صفر رسیده است. نرخ بیان این ژن در گیاهان تیمار شده با سالیسیلیک اسید در زمان اوج بیان (24 ساعت پس از مایهزنی) 10 برابر بیشتر از بیان این ژن در گیاهان شاهد در زمان اوج بیان (24 ساعت پس از مایهزنی) میباشد.
در گیاهان تیمار شده با جاسمونیک اسید نیز میزان بیان این ژن در پاسخ به آلودگی باکتریایی 12 ساعت پس از مایهزنی افزایش داشت (1/7 برابر نسبت به زمان صفر) و پس از آن نیز بیان این ژن تا 48 ساعت پس از آلودگی به افزایش خود ادامه داد و بیشینه بیان این ژن نیز در همین ساعت مشاهده شد (حدود 5/37 برابر افزایش نسبت به زمان صفر). نرخ بیان این ژن پس از زمان اوج کاهش یافت و در ساعت 72 پس از مایهزنی به کمترین میزان بیان خود یعنی 5/1 برابر بیشتر از بیان این ژن در زمان صفر رسید. نرخ بیان این ژن در گیاهان تیمار شده با جاسمونیک اسید در زمان اوج بیان (48 ساعت پس از مایهزنی) 7/1 برابر بیشتر از بیان این ژن در گیاهان شاهد در زمان اوج بیان (24 ساعت پس از مایهزنی) میباشد (شکل 2).
پروتئین PR5 یا Thaumatin Like Protein سبب تغییر نفوذپذیری اجزای ساختاری دیواره سلولی باکتری شده و در نهایت سبب مرگ سلول باکتری می‌گردد (Vidhyasekaran, 2002).
شکل 2- الگوی بیان ژن PR5 در گیاه شاهد، تیمار شده با سالیسیلیک اسید و جاسمونیک اسید در زمانهای مختلف پس از آلودگی با باکتری Pst.
Figure 2- PR5 pattern of gene expression in control plants, treated with salicylic acid and jasmonic acid in various times after infection with Pst.
نتایج حاصله از آنالیز بیان ژن PR5 هم در گیاهان شاهد و هم در گیاهان تیمار شده با هورمون‌های سالیسیلیک اسید و جاسمونیک اسید هم گویای این مطلب میباشد که سطح بیان ژن PR5 همانند الگوی PR1b در ساعت 12 پس از مایهزنی شروع به افزایش میکند. افزایش بیان ژنهای القاء شونده توسط SA در این ساعت رابطه مستقیم با افزایش تجمع این مولکول سیگنال دارد. فعالیت ضد‌قارچی PR5 در گیاه آرابیدوپسیس طی آلودگی با قارچ‌های ورتیسیلیم و فوزاریوم مشاهده شد (Fitzgerald et al., 2004; Xu and Reddy 1997). افزایش بیان اسموتین، یک عضو از خانواده پروتئین PR5، در گیاه سیب زمینی تراریخته، منجر به ایجاد مقاومت در برابر قارچ Phytophthora infestans شد (Liu et al., 1994). در این مطالعه میزان نسخههای PR5 در هر سه تیمار، پس از آلوده‌سازی گیاهان با Pst افزایش یافت، اما میزان بیان آن در تیمارها متفاوت بود. در گیاه شاهد همانند گیاه تیمار شده با سالیسیلیک اسید بیان ژن PR5 24 ساعت پس از آلودگی به اوج خود رسید ولی میزان بیان آن نسبت به تیمار سالیسیلیک اسید بسیار پایین‌تر بود که این امر بیانگر اهمیت هورمون سالیسیلیک اسید در تعامل گیاه با باکتری Pst است. اما در تیمار جاسمونیک اسید بیان این ژن 48 ساعت پس از آلودگی به حداکثر رسید و نرخ بیان آن در همه بازهها بیشتر از گیاه شاهد و کمتر از تیمار سالیسیلیک اسید بود. نتایج بررسی‌های دیگر محققین نیز بیانگر افزایش بیان این ژن پس از آلودگی در گیاهان بود (Yang et al., 2013).
در گیاهان شاهد میزان بیان ژن WRKY12 در پاسخ به آلودگی باکتریایی 12 ساعت پس از مایه زنی شروع به افزایش کرد و تا 72 ساعت پس از آلودگی نیز این افزایش بیان ادامه داشت. نرخ بیان این ژن در زمان اوج در حدود 1/7 برابر نسبت به زمان صفر افزایش داشت.
در گیاهان تیمار شده با هورمون سالیسیلیک اسید میزان بیان این ژن در پاسخ به آلودگی باکتریایی 12 ساعت پس از مایهزنی افزایش داشت (در حدود 3 برابر افزایش نسبت به زمان صفر). پس از آن نیز بیان این ژن تا 48 ساعت پس از آلودگی به افزایش خود ادامه داد و بیشینه بیان این ژن نیز در همین ساعت مشاهده شد(در حدود 21 برابر افزایش نسبت به زمان صفر). نرخ بیان این ژن پس از زمان اوج کاهش یافت و در ساعت 72 پس از مایهزنی به کمترین میزان بیان خود یعنی در حدود 1/1 برابر بیشتر از بیان این ژن در زمان صفر رسیده است. نرخ بیان این ژن در گیاهان تیمار شده با سالیسیلیک اسید در زمان اوج بیان (48 ساعت پس از مایهزنی) 5/5 برابر بیشتر از بیان این ژن در گیاهان شاهد در زمان اوج بیان (72 ساعت پس از مایهزنی) میباشد.
در گیاهان تیمار شده با جاسمونیک اسید نیز میزان بیان این ژن در پاسخ به آلودگی باکتریایی 12 ساعت پس از مایهزنی جهش اندکی داشته و پس از آن نیز بیان این ژن تا 48 ساعت پس از آلودگی به افزایش خود ادامه داد و بیشینه بیان این ژن نیز در همین ساعت مشاهده شد (در حدود 5/6 برابر افزایش نسبت به زمان صفر). نرخ بیان این ژن پس از زمان اوج کاهش یافت و در ساعت 72 پس از مایهزنی به کمترین میزان بیان خود یعنی در حدود 3/3 برابر بیشتر از بیان این ژن در زمان صفر رسیده است. نرخ بیان این ژن در گیاهان تیمار شده با جاسمونیک اسید در زمان اوج بیان (48 ساعت پس از مایهزنی) 1/1 برابر بیشتر از بیان این ژن در گیاهان شاهد در زمان اوج بیان (72 ساعت پس از مایهزنی) میباشد (شکل3).
متصل شدن فاکتور رونویسی WRKY12 به DNA برای فعالسازی ژن پایین دست PR1b مهم استد (Verk et al., 2010). پروتئینهای NPR1 با اعضای خانواده WRKY واکنش داده و بیان ژن پایین دست را تحریک می‌نمایند (Johnson et al., 2003). سرکوب شدن این فاکتورهای رونویسی از بیان ژنهای PR جلوگیری میکند (Boyle et al., 2009). افزایش بیان ژن WRKY45 در گیاه برنج منجر به ایجاد مقاومت وابسته به مسیر SA در برابر بیماری بلاست میشود (Shimono et al., 2012). مشاهده شد که افزایش بیان ژن NtWRKY12 در توتون منجر به افزایش مقاومت به عوامل باکتریایی بیماری‌زا در توتون شده است (Verk et al., 2010). در تحقیق مشاهده شد که در موتانت‌هایی با کاهش عملکرد WRKY70، مقاومت وابسته به SA در برابر پاتوژنهای قارچی Erysiphe cichoracearum مختل شده است (Li et al., 2006). در این پژوهش با توجه به حداکثر بیان ژن NtWRKY12 در ساعت 48 پس از مایهزنی باکتری و دیگر نتایج به دست آمده میتوان گفت که این ژن نقش مهمی درمسیر‌های سیگنالدهی دفاعی و بیان ژنهایی مانند PR1b دارد. نتایج بررسی‌های دیگر محققین نیز بیانگر افزایش بیان این ژن پس از آلودگی در گیاهان بود (Yang et al., 2013). اختلاف چشمگیر بیان ژن NtWRKY12 در گیاهان شاهد و تیمار شده با سالیسیلیک اسید در تمام زمانهای مورد بررسی بیانگر نقش مهم سالیسیلیک اسید در دفاع علیه Pst است.
در گیاهان شاهد میزان بیان ژن PAL در پاسخ به آلودگی باکتریایی 12 ساعت پس از مایهزنی شروع به افزایش کرد. پس از آن نیز بیان این ژن تا 24 ساعت پس از آلودگی به افزایش خود ادامه داد و بیشینه بیان این ژن در همین ساعت مشاهده شد (حدود 5/1 برابر افزایش نسبت به زمان صفر). نرخ بیان این ژن پس از زمان اوج کاهش یافت و 72 ساعت پس از مایهزنی به کمترین میزان بیان خود یعنی در حدود 1/1 برابر بیشتر از زمان صفر رسید.
در گیاهان تیمار شده با هورمون سالیسیلیک اسید میزان بیان این ژن در پاسخ به آلودگی باکتریایی 12 ساعت پس از مایهزنی جهش قابل توجهی داشته و بیشینه بیان این ژن در همین ساعت مشاهده شد (در حدود 6/5 برابر افزایش نسبت به زمان صفر). نرخ بیان این ژن پس از زمان اوج کاهش یافت و 72 ساعت پس از مایهزنی به کمترین میزان بیان خود یعنی در حدود 2/1 برابر بیشتر از زمان صفر رسید. ضمناً نرخ بیان این ژن در گیاهان تیمار شده با سالیسیلیک اسید در زمان اوج بیان (12 ساعت پس از مایه زنی) 8/3 برابر بیشتر از بیان این ژن در گیاهان شاهد در زمان اوج بیان (24 ساعت پس از مایهزنی) میباشد. در گیاهان تیمار شده با جاسمونیک اسید میزان بیان این ژن در پاسخ به آلودگی باکتریایی 12 ساعت پس از مایهزنی جهش اندکی داشت و تا 24 ساعت پس از آلودگی به افزایش خود ادامه داد و بیشینه بیان این ژن در همین ساعت مشاهده شد (حدود 3/2 برابر افزایش نسبت به زمان صفر). نرخ بیان این ژن پس از زمان اوج کاهش یافت و 72 ساعت پس از مایهزنی به کمترین میزان بیان خود یعنی حدود 3/1 برابر بیشتر از زمان صفر رسید. ضمناً نرخ بیان این ژن در گیاهان تیمار شده با جاسمونیک اسید در زمان اوج بیان (24 ساعت پس از مایهزنی) 3/2 برابر بیشتر از بیان این ژن در گیاهان شاهد در زمان اوج بیان (24 ساعت پس از مایهزنی) میباشد (شکل 4)
شکل 3- الگوی بیان ژن WRKY12 در گیاه شاهد، تیمار شده با سالیسیلیک اسید و جاسمونیک اسید در زمانهای مختلف پس از آلودگی با باکتری Pst.
Figure 3- WRKY12 pattern of gene expression in control plants, treated with salicylic acid and jasmonic acid in various times after infection with Pst.
شکل 4- الگوی بیان ژن PAL در گیاه شاهد، تیمار شده با سالیسیلیک اسید و جاسمونیک اسید در زمانهای مختلف پس از آلودگی با باکتری Pst.
Figure 4- PAL pattern of gene expression in control plants, treated with salicylic acid and jasmonic acid in various times after infection with Pst.
محصول ژن Phenylalanin ammonia lyaze آنزیمی حیاتی در مسیر Phenylpropanoid بوده که اولین واکنش در تولید ترکیبات طبیعی فنیل پروپانوئیدی مثل لیگنین، رنگ‌دانه‌ها، فلاوونوئید و فیتوالکسین را کاتالیز میکند (Blilou et al., 2000).
مشخص شده که افزایش مقدار RNA پیامبر PAL، مبنای افزایش فعالیت آن میباشد. گیاهان توتون که فعالیت PAL در آنها کم میباشد، لیگنین کمتری در دیواره داشته و نسبت به تهاجم بیمارگرها حساستر میباشند (Vidhyasekaran, 2002). با توجه به اطلاعات بدست آمده و همچنین با توجه به مطالب ذکر شده پیرامون بررسی نقش آنزیم PAL، میتوان گفت که فیتوالکسینها در مقاومت توتون به باکتری Pst نقش بسزایی دارند. همچنین مشخص شد که این آنزیم نقش مهمی در HR دارد که تفاسیر ما را پیرامون تعاملات باکتری Pst و توتون تائید مینماید (Silva et al., 2006). همچنین این آنزیم اولین آنزیم دخیل در مسیر سنتز فیتوآلکسینها است (Coquoz et al., 1998). افزایش بیان PAL در گیاه توتون با افزایش تجمع ترکیبات فنلی ضدمیکروبی، مقاومت به Cecospora nicotiana و Phytophthora parasitica pv. nicotiana را افزایش میدهد (Way et al., 2002; Shadle et al., 2003). همچنین پژوهش‌های قبلی نقش ژن PAL را در مقاومت گیاه برنج به باکتری Acidovorax avenae subsp. Avenae نشان می دهد (Heydarinezhad et al., 2016). با این حال، مواردی گزارش شده که تغییر درترکیبات فنلی، منجر به افزایش حساسیت در برابر عوامل بیماری‌زا شده است (Hanhineva et al., 2009). ترکیبات PAL در واکنشهای مقاوم بسیار سریعتر از واکنشهای حساس تجمع پیدا میکنند که این با نتایج به دست آمده در این تحقیق همخوانی دارد. در این پژوهش مشخص شد که ترکیبات PAL در گیاهان تیمار شده با سالیسیلیک اسید سریعتر از گیاهان شاهد و همچنین تیمار شده با جاسمونیک اسید تجمع پیدا میکنند. نتایج بررسی‌های دیگر محققین نیز بیانگر افزایش بیان این ژن پس از آلودگی در گیاهان بود (Yang et al., 2013). فیتوآلکسینها نیز بعد از آسیب برگشت‌ناپذیر به غشای سلول در گیاه تجمع می‌یابند. فیتوآلکسینها به سرعت در همکنشهای مقاوم/ ناسازگار که به صورت واکنش فوق‌حساسیت قابل تشخیص هستند، تجمع پیدا میکنند. مرگ سلولی، قبل از تجمع فیتوآلکسینها درون بافت آلوده اتفاق می‌افتد (Vidhyasekaran, 2002).
در گیاهان شاهد سطح فراوانی رونوشت‌های ژن CAT، 12 پس از آلودگی افزایش قابل توجهی داشت (حدود 3/4 برابر) و سپس روند کاهشی به خود گرفت. نرخ بیان این ژن در گیاهان شاهد در زمان اوج بیان (12 ساعت پس از مایهزنی) حدود 2/3 برابر بیشتر از بیان این ژن در گیاهان تیمار شده با سالیسیلیک اسید در زمان اوج بیان میباشد. نرخ بیان این ژن در گیاهان شاهد در زمان اوج بیان (12 ساعت پس از مایه زنی) حدود 3/3 برابر بیشتر از بیان این ژن در گیاهان تیمار شده با جاسمونیک اسید در زمان اوج بیان (12 ساعت پس از مایهزنی) میباشد.
در گیاهان تیمار شده با هورمون سالیسیلیک اسید برخلاف آنچه در الگوی بیان ژن کاتالاز در گیاهان شاهد مشاهده شد، سطح فراوانی رونوشت‌های ژن CAT در ساعت 12 پس از ایجاد آلودگی افزایش ناچیزی داشت (در حدود 9/1 برابر افزایش نسبت به زمان صفر) و سپس تا زمان 72 پس از تلقیح به شدت کاهش یافت.
در گیاهان تیمار شده با هورمون جاسمونیک اسید میزان سطح فراوانی رونوشت‌های این ژن 12 ساعت پس از ایجاد آلودگی افزایش ناچیزی داشت (در حدود 3/1 برابر افزایش نسبت به زمان صفر) و سپس تا زمان 72 پس از تلقیح به شدت کاهش یافت (شکل 5).
شکل 5- الگوی بیان ژن CAT در گیاه شاهد، تیمار شده با سالیسیلیک اسید و جاسمونیک اسید در زمانهای مختلف پس از آلودگی با باکتری Pst
Figure 5- CAT pattern of gene expression in control plants, treated with salicylic acid and jasmonic acid in various times after infection with Pst.
انفجار اکسیداتیو با هدف قرار دادن مستقیم بیمارگر در اولین مراحل آلودگی، به عنوان اولین مرحله دفاعی گیاهان مقاوم به شمار میرود. کاتالاز که H₂O₂ را تجزیه میکند، باکتری را مقابل اثرات AOS محافظت میکنند و موجب کاهش اثرات تنشهای اکسیداتیو که به وسیله عوامل محیطی مختلف ایجاد میشود، میگردند. در این مطالعه در گیاهان تیمار شده با سالیسیلیک اسید و همچنین جاسمونیک اسید، سطوح پایین بیان ژن CAT موجب مرگ برنامه‌ریزی شده سلولی (PCD) به عنوان پاسخی بر علیه عوامل بیماریزای باکتریایی فعال میشود که نشان دهنده‌ی حضور و فعالیت سیستمی سرکوبگر در مسیر بیان این ژن میباشد. این نتایج با یافته‌های محققین دیگر مطابقت دارد (Yang et al., 2013). در حالی که در گیاه شاهد سطح بالای بیان ژن CAT موجب حذف مولکول سیگنال H₂O₂ میشود (Neill et al., 2002). بنابراین به جهت فعالسازی واکنش فوق‌حساسیت که خود به تجمع مولکول H₂O₂ وابسته است، میبایست بیان و فعالیت ژن CAT سرکوب شوند (Mittler et al., 2004).
مطالعات نشان میدهد که گیاهان در مقابله با عوامل بیوتروف عمدتا با مکانیسم‌های مرگ سریع سلولی، محکم کردن دیواره سلولی در محل نفوذ بیمارگر و با افزایش تولید بعضی از پروتئینهای ضد میکروبی مثل پروتئینهای PR از نفوذ و توسعه بیمارگر در خود جلوگیری میکنند. پیش نیاز تولید ارقام مقاوم، شناسایی مکانیسم‌های درگیر در واکنش به عوامل بیماری‌زا است که منجر به ظهور مقاومت در ارقام مقاوم و حساسیت در ارقام حساس گیاهی میشود (Baker et al., 1997). بنابراین درک درست از روند تخریب بیماری و همچنین مقاومت میزبان به بیمارگر ممکن است به محقق کمک کند تا با ایده‌های تحقیقاتی بیشتری برای غلبه بر بیماری گام بردارد. با توجه به تغییرات مشاهده شده نقش ژنهای مطالعه شده در این تحقیق در مقاومت به بیمارگر‌های مختلف در گیاهان بخوبی روشن است. در آلودگی آتشک توتون، تصور میشود این ژن‌ها در ارتباط با پاسخ‌های دفاعی گیاه دارای نقش باشند. با توجه به نتایج این تحقیق، هورمون سالیسیلیک اسید قادر به القای بیشتر ژنهای PAL، مرتبط با بیماری‌زایی (PR1، PR5) و فاکتور رونویسی WRKY12 در مقایسه با JA در گیاه توتون است. علاوه بر این در گیاهان تیمار شده با هورمون‌های فوق، آنزیم کاتالاز کاهش قابل توجهی یافت که خود باعث افزایش تجمع رادیکال‌های آزاد اکسیژن و بیشتر شدن پاسخ مقاومتی مرگ سلولی و افزایش مقاومت گیاه به آتشک توتون میشود. در مجموع میتوان گفت این هورمون‌‌ها به عنوان القا کننده زیستی کارآمد بوده و از طریق القای سیستم بیان ژن و تولید آنزیم‌ها باعث مقاومت گیاه به بیماری آتشک توتون می‌شوند. با توجه تاثیر بیشتر هورمون SA میتوان از آن در مدیریت این بیماری با تیمار آن روی گیاه و یا تولید تراریختهایی از توتون که در آن تولید این هورمون بیشتر باشد و یا تراریختهایی که دارای سطح بیشتری از ژن PAL یا سرکوب کنندههای آنزیم کاتالاز باشد، بهره جست.
منابع
Agrios GN (2005). Plant pathology. 5th ed. Academic press, San Diago, 922.
Baker B, Zambryski P, Staskawicz B, Dinesh-Kumar SP (1997). Signaling in Plant Microbe Interactions. Science 276: 726-733.
Blilou I, Ocampo JA, Garcia-Garrido JM (2000). Induction of Ltp (lipid transfer protein) and Pal (phenylalanine ammonia-lyase) gene expression in rice roots colonized by the arbuscular mycorrhizal fungus Glomus mosseae. Journal of experimental botany 51: 1969-1977.
Block A, James R (2011). Plant targets for Pseudomonas syringae type III effectors. Plant Physiology 123: 1341–1356.
Boyle P, Su EL, Rochon A, Shearer HL, Murmu J, ChuJY, Fobert PR, Despres C (2009). The BTB ⁄ POZ domain of the Arabidopsis disease resistance protein NPR1 interacts with the repression domain of TGA2 to negate its function. Plant Cell 21: 3700–3713.
Campbell MM, Ellis BE (1992). Fungal elicitor- medated responses in pine cell cultures: III. Purification and characterization of phenylalanine ammonia-lyase. Plant Physiology 98: 62-70.
Coquoz J, Buchala A, Metraux JP (1998). The biosynthesis of salicylic acid in potato plants. Plant Physiology Biochemistry 117: 1095-1101.
Dahleen L, Okubara PA, Blech AE (2001). Transgenic approaches to combat fusarium head blight in wheat and barley. Crop Science 41: 628-637.
Fitzgerald HA, Chern MS, Navarre R, Ronald PC (2004). Overexpression of (At)NPR1 in rice leads to a BTH- and environmentinduced lesion-mimic/cell death phenotype. Molecular Plant-Microbe Interaction 17: 140-151.
Ganapathi TR, Suprasanna P, RaoPS, Bapat VA (2004).Tobacco (Nicothiana tobacum L.)A model system for tissue culture intervention and genetic engineering. Indian Journal of Biotechnology 3: 171-184.
Glazebrook J (2005). Contrating mechanisms of defense against biotrophic and necrotrophic pathogens. Annual Review of Phytopathology 43: 205–227.
Grunwald I, Rupprecht I, Schuster G, Kloppstech K (2003). Identification of guttation fluid proteins: the presence of pathogenesis- related proteins in noninfected barley plant. Physiologia Plantarum 119: 192-202.
Hanhineva K, Kokko H, Siljanen H, Rogachev I, Aharoni A, Karenlampi SO (2009). Stilbene synthase gene transfer caused alterations in the phenylpropanoid metabolism of transgenic strawberry (Fragariaxananassa). Journal Experimental Botany 60: 2093-2106.
He R, Chang Z, Yang Z, Zhan H, Zhang X, Liu J. (2009). Inheritance and mapping of powdery mildew resistance gene Pm43 introgreessed from Thinopyrum intermedium into wheat. Theoretical and Applied Genetics 118: 1173-1180.
Heil M, RM Bostock (2002). Induced systemic resistance (ISR) against pathogens in the context of induced plant defences. Annual Botany 89: 503-512.
Heydari-Nezhad AM, Babaeizad V, Rahimian H (2016). Studying PR2 and PAL genes involvement in rice resistance against Acidovorax avenae subsp. Avenae. Journal of Agricultural Biotechnology 7: 67-82 (In Farsi).
Hoegen E, Stromberg A, Pihlgren U, Kombrink E (2002). Primary structure and tissue specific expression of the pathogenesis- related protein PR-1b in potato. Molecular Plant Pathology 3: 329-345.
Johnson C, Boden E, Arias J (2003). Salicylic acid and NPR1 induce the recruitment of trans-activating TGA factors to a defense gene promoter in Arabidopsis. Plant Cell 15: 1846-1858.
Kitajima S, Sato F (1999). Plant pathogenesis-related proteins: Molecular mechanisms of gene expression and protein function. Journal of Biochemistry 125: 1-8.
Klement Z, Rudolph K, Sands DC (1990). Methods in Phytobacteriology. Akademiai Kiado, Budapset 568.
Kogel KH, Langen G (2005). Induced disease resistance and gene expression in cereals. Journal Cellular Microbiology 11: 1555-1564.
Li J, Brader G, Palva ET (2004). The WRKY70 transcription factor: A node of convergence for jasmonate-mediated and salicylate-mediated signals in plant defense. Plant Cell 16: 319-331.
Li J, Brader G, Kariola T, Palva ET (2006). WRKY70 modulates the selection of signaling pathways in plant defense. Plant Journal 46: 477-491.
Lillemo M, Asalf B, Singh RP, Huerta-Espino J, Chen XM, He ZH Bjrnstad A (2008). The adult plant rust resistance loci Lr34/Yr18 andLr46/Yr29 are important determinants of partial resistance to powdery mildew in bread wheat line saar. Theoretical and Applied Genetics 116: 1155-1166.
Liu D, Raghothama KG, Hasegawa PM, Bressan RA (1994). Osmotinoverexpression in potato delays development of disease symptoms. proceedings of the national academy of sciences USA 91: 1888–1892.
Livak KJ, Schmittgen TD (2001). Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2 -(ΔΔCT) CT method. Methods 25: 402-408.
Mittler R, Vanderauwera S, Gollery M, Van Breusegem F (2004). Reactive oxygen gene network of plants. Trends Plant science 9: 490–498.
Moralejo FJ, Cardoza RE, Gutierrez S, Martin JF (1999). Thaumatin production in Aspergillus awamori by use of expression cassettes with strong fungal promoters and high gene dosage. Applied and Environmental Microbiology 65: 1168–1174.
Muchembled J, Lounes-Hadj shahraoui A, Grandmougin-Fer jani A, Sanchollen M (2006). Changes in lipid composition of Blumeria graminis f.sp. tritici conidia produced on wheat leaves treated with heptanoyl SA. Phythochemistry 67: 1104-1109.
Neill SJ, Desikan R, Clarke A, Hurst RD, Hancock JT (2002). Hydrogen peroxide and nitric oxide as signalling molecules in plants. Journal of Experimental Botany 53: 1237–1247.
Oh S, Baek K, Park J, Yi S, Yu S, Kamoun S, Choi D (2008). Capsicum annuum WRKY protein CaWRKY1 is a negative regulator of pathogen defense. New Phytology 177: 977–989.
Raskin I (1992). SalisylateT a new plant hormone. Plant Physiology 99: 799-803.
Rasmussen J, Hammerschmidt R, Zook NM (1991). Systemic Induction of Salicylic Acid Accumulation in Cucumber after Inoculation with Pseudomonas syringae pv syringae. Plant Physiology 97: 1342-1347.
Rate DN, Greenberg JT (2001). The Arabidopsis aberrant growth and death2 mutant shows resistance to Pseudomonas syringae and reveals a role for NPR1 in suppressing hypersensitive cell death. Plant Journal 27: 203-2110.
Rauscher M, Adam AL, Wirtz S, Guggenheim R, Mendgen K, Deising HB (1999). PR-1 protein inhibits the differentiation of rust infection hyphae in leaves of acquired resistant broad bean. Plant Journal 19: 625-633.
Schaller F (2001). Enzymes of the biosynthesis of octadecanoid-derived signaling molecules. Journal Experimental Botany 52: 11-23.
Schmidt G, Delaney S (2010). Stable internal reference genes for normalization of real-time RT-PCR in tobacco (Nicotiana tabacum) during development and abiotic stress. Molecular Genetics and Genomics 283: 233-241.
Schulthesis H, Derchert C, Kogel KH, Huckelhoven R (2003). Functional analysis of barley PAC/ROP G-protein family members in susceptibility to the powdery mildew fungus. Plant Journal 36: 589-601.
Sels J, Mathys M, De Coninck BMA, Cammue BPA (2008). Plant pathogenesis- related (PR) proteins: A focus on PR peptides. Plant Physiology and Biochemistry 46: 941-950.
Shadle GL, Wesley SV, Korth KL, Chen F, Lamb C, Dixon RA. (2003). Phenylpropanoid compounds and disease resistance in transgenic tobacco with altered expression of L-phenylalanine ammonia-lyase. Phytochemistry 64: 153-161.
Shah J, Klessig DF (1999). Salisylic acid: signal perception and transduction. In: Libbenga K, Hall M, Hooykaas PJJ (Eds.). new comprehensive biochemistry. Biochemistry and Molecular Biology Plant hormones. Elsevier UK: 513-554.
Silva MD, Várzea V, Guimarães LG, Azinheira HG, Nicole M (2006). Coffee resistance to the main diseases: leaf rust and coffee berry disease. Brazil Journal of Plant Physiology 18: 119-147.
Shimono M, Koga H, Akagi A, Hayashi N, Goto S, Sawada M, Kurihara T, Matsushita A, Sugano S, Jiang CJ, Kaku H, Inoue H, Takasuji H (2012). Rice WRKY45 plays important roles in fungal and bacterialdisease resistance. Molecular Plant Pathology 13: 83–94.
Song F, Goodman RM, (2001). Molecular biology of disease resistance in rice. Physiological and Molecular Plant Pathology 59: 1-11.
Sticher L, Mauchmani B, Metraux JP (1997). Systemic acquired resistance. Annual Review of Phytopathology 35: 235- 270.
Stotz HU, Thomson J, Wang Y (2009). Plant defensins: defense, development and application. Plant Signaling & Behavior 4: 1010-1012.
Thomma BPHJ, Eggermont K, Penninckx IAMA, Mauch-Mani B,Vogelsang R, Cammue BPA, Broekaert WF (1998). Separate Jasmonate- dependent and salicylate- dependent defense- response pathway s in Arabidopsis are essential for resistance to distinct microbial pathogens. Proceeding of the Nothinal Academy of Science of USA 95: 15107-15111.
Traw MBd, Bergelson J (2003). Interactive effects of jasmonic acid, salicylic acid and gibberellin induction of trichomes in Arabidopsis. Plant Physiology 133: 1367-1375
Van Loon LC, Rep M, Pieterse CMJ (2006). Significance of inducible defense- related proteins in infected plants. Annual Review Phytopathology 44: 135-162.
Verk MC, Neeleman L, Bol JF, Huub JM (2010). Tobacco Transcription Factors NtWRKY12 and TGA2.2 Interact in vitro and in vivo and Activate PR-1a Gene Expression. Plant Physiology 123: 1341–1356.
Vidhyasekaran P (2002). Bacterial Disease Resistance in Plants: Molecular Biology and Biotechnological Application.
Vigers AJ, Roberts WK, Selitrennikoff CP (1991). A new family of plant antifungal proteins. Molecular Plant Microbe Interactions 4: 315-323.
Way HM, Kazan K, Mitter N, Goulter KC, Birch RG, Manners JM (2002). Constitutive expression of a phenylalanine ammonia-lyasegene from Stylosanthes humilisin transgenic tobacco leads to enhanced disease resistance but impaired plant growth. Physiology Molecular Plant Pathology 60: 275-82.
Xu H, Reddy ASN (1997). Cloning and expression of a PR5-like protein from Arabidopsis: inhibition of fungal growth by bacterially expressed protein. Plant Molecular Biology 34: 949–959.
Yang L, li W, Guohua C, Shanshan J, Liping S, Dequan L (2013). Response of tobacco to the Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 is mainly dependent on salisylic acid signaling pathway. FEMS Microbiology Letters 344: 77-85.
Yu KW, Gao W, Hahn EJ, Paek KY (2002). Jasmonic acid improves ginsenoside accumulation in adventitious root culture of panax ginseng C.A. Mayer. Journal of Biochemistry 11: 211-215.
Zhang Y, Wang L (2005). The WRKY transcription factor superfamily: its origin in eukaryotes and expansion in plants. BMC Evolutionary Biology 5: 1–12.
Induction of several Pathogenesis-Related genes in tobacco plants treated by salicylic and jasmonic acid after challenging with Pseudomonas syringae pv. Tabaci
Farajollahi F.1*, BabaeizadV. 2, Rahimian H. 3
1Master in Plant Pathology of Sari Agricultural Sciences and Natural Resources University, Sari, Iran.
2Associate Professor in Plant Protection Department of Sari Agricultural Sciences and Natural Resources University, Sari, Iran.
3Professor in Plant Protection Department of Sari Agricultural Sciences and Natural Resources University, Sari, Iran.
Abstract
Tobacco as a model plant (owing to certain features) is extensively used in molecular research with the aims to understand the fundamental plant and pathogen interactions. Fire blight bacterial disease of tobacco (Pseudomonas syringae pv. tabaci (Pst)) causes considerable damage to tobacco worldwide. Induction of genes associated with virulence that play a role in resistance to diseases can be effective in reducing the severity of disease. The evidence suggests that plant hormones are effective in gene expression in plants and increase the production of secondary metabolites. In addition, they stimulate the immune system of plant through the activation of transcription of genes linked with plant defense mechanisms that regulate the induced resistance. In this study, the expression of PR1, PR5, Pal, Catalase and WRKY12 in tobacco plants treated with salicylic acid at a concentration of 3 mM and tobacco plant treated with jasmonic acid at a concentration of 0.5 mM and also control plant in times 0, 12, 24, 48 and 72 after injection of Pseudomonas syrigae pv. tabaci was investigated by Quantitative Real-time PCR (QRT-PCR) technique. The results showed that jasmonic acid and particularly salicylic acid treatments caused significant changes in the expression of these genes after bacterial injection.
key words: Fire blight, Salicylic acid, Jasmonic acid, QRT-PCR, Resistance genes.
)
