نوع مقاله : مقاله پژوهشی
نویسندگان
1 دانشجوی دکتری بیماریشناسی گیاهی، دانشکده علوم کشاورزی ﺩﺍﻧﺸﮕﺎﻩ گیلان، رشت، ایران.
2 دانشیار بخش ﻭﻳﺮﻭﺱ ﺷﻨﺎﺳﻲ ﮔﻴﺎﻫﻲ، ﻣﻮﺳﺴﻪ ﺗﺤﻘﻴﻘﺎﺕ ﮔﻴﺎﻩ ﭘﺰﺷﻜﻲ ﻛﺸﻮﺭ، سازمان تحقیقات آموزش و ترویج کشاورزی ایران، ﺗﻬﺮﺍﻥ، ایران.
3 استادیار بخش ﺑﻴﻮﺗﻜﻨﻮﻟﻮژﻱ ﮔﻴﺎﻫﻲ، ﭘﮋﻭﻫﺸﮕﺎﻩ ﻣﻠﻲ ﻣﻬﻨﺪﺳﻲ ژﻧﺘﻴﻚ ﻭ ﺯﻳﺴﺖ ﻓﻦ ﺁﻭﺭﻱ، ﺗﻬﺮﺍن، ایران.
4 استاد گروه بیماریشناسی گیاهی، دانشکده علوم کشاورزی ﺩﺍﻧﺸﮕﺎﻩ گیلان، رشت، ایران.
5 استادیار گروه علوم و زیست فناوری گیاهی، دانشکده علوم و فناوری زیستی، ﺩﺍﻧﺸﮕﺎﻩ شهید بهشتی،تهران، ایران.
چکیده
کلیدواژه‌ها
عنوان مقاله [English]
نویسندگان [English]
Citrus bacterial canker is a disease caused by Xanthomonas citri subsp. citri (Xcc). The bacterial type III secretion system (TTSS) consist of an extracellular filamentous structure mediating transfer of bacterial proteins into the plant cytosols. The main part of the pilus is pilin protein (HrpE) that is encoded by the HrpE gene. Production of specific antibodies against the pilin protein can be implemented for detection of infected plants as well as to develop a source of genetic resistance against disease. Inhibition of HrpE protein through antibody therapy leads to suppression of disease in the plant. The objective of the present study was to isolate, clone and express the HrpE gene. To do this, the HrpE gene was amplified by PCR using gene-specific primers and cloned to the pTZ57R/T vector. Then, it was cloned to the pET28a(+) bacterial expression vector and expressed in the E. coli strain Rosetta as host. The protein production procedure was optimized for incubation time and temperature as well as the concentration of inducer. The greatest amount of the recombinant protein was yielded at 1 mM IPTG at 30° C for 16 h. Purification of HrpE recombinant protein was done via metal affinity chromatography. The results of both SDS-PAGE and Western blotting assays confirmed the expression accuracy and purity of recombinant pilin protein. The recombinant protein can be used as an antigen to develop monoclonal and polyclonal antibodies.
کلیدواژه‌ها [English]
همسانه سازی و بیان ژﻥ پیلین باکتری Xanthomonas citri subsp. citri
حمیده رئیسی1، محمدرضا صفرنژاد*2، سید مهدی علوی3، سید علی الهی نیا4، ناصر فرخی5
1 دانشجوی دکتری بیماریشناسی گیاهی، دانشکده علوم کشاورزی ﺩﺍﻧﺸﮕﺎﻩ گیلان، رشت، ایران.
2 دانشیار بخش ﻭﻳﺮﻭﺱ ﺷﻨﺎﺳﻲ ﮔﻴﺎﻫﻲ، ﻣﻮﺳﺴﻪ ﺗﺤﻘﻴﻘﺎﺕ ﮔﻴﺎﻩ ﭘﺰﺷﻜﻲ ﻛﺸﻮﺭ، سازمان تحقیقات آموزش و ترویج کشاورزی ایران، ﺗﻬﺮﺍﻥ، ایران.
3 استادیار بخش ﺑﻴﻮﺗﻜﻨﻮﻟﻮژﻱ ﮔﻴﺎﻫﻲ، ﭘﮋﻭﻫﺸﮕﺎﻩ ﻣﻠﻲ ﻣﻬﻨﺪﺳﻲ ژﻧﺘﻴﻚ ﻭ ﺯﻳﺴﺖ ﻓﻦ ﺁﻭﺭﻱ، ﺗﻬﺮﺍن، ایران.
4 استاد گروه بیماریشناسی گیاهی، دانشکده علوم کشاورزی ﺩﺍﻧﺸﮕﺎﻩ گیلان، رشت، ایران.
5 استادیار گروه علوم و زیست فناوری گیاهی، دانشکده علوم و فناوری زیستی، ﺩﺍﻧﺸﮕﺎﻩ شهید بهشتی،تهران، ایران.
تاریخ دریافت: 16/08/1396، تاریخ پذیرش: 23/10/1396
چکیده
بیماری شانکر باکتریایی مرکبات توسط باکتری Xanthomonas citri subsp. citri (Xcc) ایجاد میشود. سیستم ترشحی نوع سه این باکتری دارای یک ساختار خارج سلولی رشتهای است که پروتئینهای باکتریایی را به داخل سلول گیاه وارد میکند. پروتئین پیلین (HrpE) جزء اصلی تشکیل دهنده پیلوس می باشد که توسط ژن HrpE کد میشود. تولید پادتن اختصاصی علیه پروتئین پیلین میتواند به منظور شناسایی گیاهان آلوده و همچنین به عنوان منبع ژنتیکی مقاومت علیه بیماری مورد استفاده قرار گیرد. غیرفعالسازی پروتئین HrpE با استفاده از پادتن میتواند منجر به سرکوب بیماری در گیاه شود. هدف از این تحقیق جداسازی و بیان ژن HrpE و خالصسازی پروتئین حاصل از آن بود. برای این منظور، قطعه ژنی HrpE با استفاده از آغازگرهای اختصاصی جدا و در ناقل pTZ57R/T همسانهسازی شد. بیان این ژن بهصورت نوترکیب در ناقل pET28a(+) و در سویه Rosetta باکتری Escherchia coli انجام شد. بهینهسازی تولید پروتئین نوترکیب تحت تاثیر زمانهای مختلف، دمای نگهداری و همچنین غلظتهای مختلف القاکننده مورد بررسی قرار گرفت. بیشترین مقادیر بیان در دمای 30 درجه سلسیوس و طی زمان 16 ساعت و با IPTG یک میلیمولار بهدست آمد. خالصسازی پروتئین نوترکیب HrpE با استفاده از روش کروماتوگرافی تمایلی بر روی ستون نیکل صورت پذیرفت. نتایج آزمونهای الکتروفورز پروتئین و وسترن بلاتینگ با استفاده از پادتنهای اختصاصی، صحت بیان و خالصسازی پروتئین نوترکیب پیلین را مورد تایید قرار دادند. پروتئین نوترکیب تولید شده میتواند به عنوان آنتیژن برای تولید پادتنهای تخصصی تک همسانهای و چند همسانهای مورد استفاده قرار گیرد.
کلمات کلیدی: شانکر باکتریایی مرکبات، پروتئین نوترکیب، سیستم ترشحی تیپ 3، ژن HrpE، پیلوس.
مقدمه
مرکبات، از محصولات باغی استراتژیک ایران است که مقام اول را در بین تولیدات باغی کشور با سطح زیرکشت 268 هزار هکتار و 3/4 میلیون تن تولید در سال دارد (Ebrahimi, 2009). با توجه به سطح زیر کشت مرکبات، سهم ایران 7/3 درصد از تولید مرکبات جهان میباشد که این میزان تولید باعث شده است ایران رتبه هفتم تولید مرکبات در جهان را به خود اختصاص دهد (FAO, 2014).
شانکر باکتریایی مرکبات از بیماریهای مهم مرکبات است که توسط باکتریXanthomonas citri subsp. citri (Xcc) ایجاد میشود (Shaad et al., 2006). لیموترش از میزبانهای این باکتری در جنوب ایران است (Khodakaramian et al., 1999). بیماری شانکر مرکبات اولین بار در اواخر قرن نوزده در ژاپن دیده شد و شرح آن توسط Clara Hasse (1915) پس از ورود به آمریکا نوشته شد (Shaad et al., 2005; Schoulties et al., 1987). در ایران بیماری شانکر مرکبات اولین بار در سال 1369 توسط علیزاده و رحیمیان در کهنوج گزارش شد (Alizadeh and Rahimian, 1990).
عامل شانکر مرکبات دارای پاتوتیپهای مختلفی (پاتوتیپ A، A* و Aw) است که روی گونههای مرکبات بیماریزا هستند. پاتوتیپ A انتشار جهانی داشته و به خاطر قدرت تهاجم زیاد و دامنه میزبانی وسیع بیشترین توجه را به خود اختصاص داده‌است. پاتوتیپهای A* و Aw از نظر دامنه میزبانی محدود بوده ولی از نظر نوع علائم مشابه پاتوتیپ A هستند. فرم آسیایی (A*) این بیماری در ایران روی میوه لیموترش گزارش شده است (Roohani et al., 2012). شانکر آسیایی مرکبات روی ارقام حساس منجر به ریزش برگ، سرخشکیدگی شاخه، ریزش زود هنگام میوه، کاهش بازارپسندی و کاهش قیمت میوه میشود (Gottwald et al., 2002; Graham et al., 2004; Duan et al., 1999).
معمولا بیماری‌زایی در باکتری‌ها تحت تاثیر ژن‌های کنترلکننده بیماری‌زایی میباشد که در کلاسترهای بزرگ ژنی قرار دارند. با بررسی توالی کلاسترهای ژنی در انواع مختلف باکتری‌ها، شباهت‌های زیادی بین این نواحی و ژن‌های دخیل در شکلگیری تاژک دیده میشود. ژن‌های دخیل در سیستم ترشح پروتئین نوع سه از جمله نواحی بسیار محافظت شده میباشند که نقش مهمی در فرآیند بیماری‌زایی در باکتریهای بیماریزای گیاهی دارند و باعث انتقال فاکتورهای بیماری‌زایی به درون سلولهای گیاهی میشود (Cornelis et al., 2000; Mokhtari et al., 2015). در سیستم ترشحی نوع سه، انتقال پروتئینهای افکتور به درون سلول گیاهی توسط یک ساختار سرنگی شکل تحت عنوان اینجکتوزوم صورت میپذیرد. بخش خارج‌سلولی اینجکتوزوم عمدتا شامل پیلوس است که بهصورت میلهای نازک و طویل قادر به نفوذ در دیواره سلولی متخلخل گیاه است (Koebnik, 2005). جز اصلی پیلوس، پروتئین پیلین HrpE است که به وسیلهی قطعه ژنی HrpE کد میشود (Buttner and Yang, 2009). این قطعه ژنی 282 نوکلئوتید دارد و موتاسیون در آن سبب عدم تشکیل پیلوس و عدم ایجاد بیماری یا واکنش فوق حساسیت (HR) میشود. بنابراین تشکیل پیلوس در برهم‌کنش‌های تحت کنترل گیاه- باکتری ضروری است (Weber et al., 2005).
در میان راهبردهای مورد استفاده در جهت مدیریت بیماری، تولید رقم مقاوم جز موثرترین روشهای پیشگیری بیماری میباشد. دستیابی به منابع مقاومت ژنتیکی از راهکارهای مهم در تولید ارقام مقاوم به بیماری است (Safarnejad et al., 2011). در تولید ارقام مقاوم علاوه بر غربالگری منابع ژنتیکی مقاومت موجود، میتوان از پادتنهای اختصاصی بر علیه پروتئینهای ضروری پاتوژن استفاده کرد (Swarup et al., 1992). بر این اساس پروتئین HrpE با توجه به وظیفه اصلی که در ایجاد بیماری دارد، میتواند به عنوان گزینهای مناسب در ایجاد مقاومت بکار گرفته شود. بیان هترولوگ پروتئین نوترکیب ﺩﺭ ﻣﻄﺎﻟﻌﺎﺕ ﻣﺮﺑﻮﻁ ﺑﻪ ﺑﺮﺭﺳﻲ ﻧﻘﺶ ﭘﺮﻭﺗﺌﻴﻦ ﻭ ﺗﻮﻟﻴﺪ ﺁﻧﺘﻲبادیهای اختصاصی میتواند در این مسیر راهگشا باشد (Ariannejad et al., 2012). بنابراین هدف از اجرای تحقیق حاضر، جداسازی و بیان ژن HrpE، خالصسازی و تولید انبوه پروتئین ژن مذکور بوده است. از پروتئین نوترکیب تولید شده میتوان در پژوهشهای بعدی به منظور تولید پادتن تک همسانهای اختصاصی برای ایجاد مقاومت به بیمارگر با ایجاد گیاهان تراریخته استفاده نمود.
مواد و روشها
سویههای باکتری و وکتور
سویه 88 باکتریX. citri subsp. citri باکتری E. coli DH5α و پلاسمید pET28a (تهیه شده از کلکسیون پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست فناوری) مورد استفاده قرار گرفتند.
استخراج DNA باکتری
باکتری در 10 میلی لیتر محیط مایع LB[1] به مدت 16 ساعت در انکوباتور شیکردار با دمای 28 درجه سلیسیوس و 150 دور در دقیقه کشت شد. به منظور استخراج DNA باکتری از کیت استخراج (Bioneer, Daejeon, South Korea) مطابق دستورالعمل مربوطه استفاده شد. کیفیت DNAی استخراجی با استفاده از ژل آگارز یک درصد مورد بررسی قرار گرفت.
تکثیر به روش واکنش زنجیرهای پلیمراز
جهت جداسازی ژن HrpE، ابتدا آغازگر اختصاصی ژن مربوطه با استفاده از منابع بانک اطلاعاتی NCBI طراحی شد و به منظور تسهیل در فرآیند همسانهسازی در وکتور بیانی، قطعات سایت برشی مربوط به آنزیمهای برشی Xho1/Sal1 در نواحی '5 آغازگرهای پیشرو و پسرو وارد شد. واکنش PCR در حجم 15 میکرولیتر انجام شد، که شامل 5/1 میکرولیتر بافرPCR (X10) ، 7/0 میکرولیتر کلرید منیزیم 50 میلیمولار، 3/0 میکرولیتر dNTP با غلظت 10 میلیمولار، یک میکرولیتر از هرکدام از آغازگرهای پیشرو و پسرو (آغازگر پیــشرو '3-TAAAATGTCGACAAATGGAATTATTACCG-'5 و آغازگر پـسرو '3-TAAAATCTCGAATTACTGGCCAACGGCTG-'5)، یک میکرولیتر DNA الگو با غلظت 10 نانوگرم و 2/0 میکرولیتر آنزیمDNA Polymerase Taq (Fermentas, Pittsburgh PA, USA) بود.
واکنش زنجیرهای پلیمراز با پنج دقیقه در دمای 94 درجه سلسیوس، 40 سیکل شامل (یک دقیقه در دمای 94 درجه سلسیوس، یک دقیقه در در دمای 60 درجه سلسیوس، 45 ثانیه در دمای 72 درجه سلیسیوس) ده دقیقه در دمای 72 درجه سلسیوس انجام شد. بعد از انجام PCR محصول واکنش به وسیلهی روش الکتروفورز روی ژل آگارز یک درصد جداسازی شد. باند مورد نظر از روی ژل با استفاده از کیت استخراج از ژل و طبق دستور العمل شرکت مربوطه (Bioneer, Daejeon, South Korea) خالصسازی شد.
همسانهسازی در وکتور PTZ57R/T
پس از تأیید محصول PCR بر روی ژل آگارز، قطعه تکثیر شده ژن HrpE در ناقل PTZ57R/T به روش T/A کلونینگ و همسانهسازی طبق دستورالعمل شرکت سازنده (InsTAcloneTM PCR Cloning Kit, Fermentas, Vilnius, Lithuania) انجام شد. تأیید همسانهسازی، به روش تعیین ترادف توسط آغازگرهای یونیورسال (T7 promoter) توسط شرکت فزاپژوه (تهران، ایران) انجام شد. استخراج پلاسمید بر مبنای کیت (Roche, Mannheim, Germany) و طبق دستورالعمل شرکت مربوطه صورت گرفت.
همسانهسازی در وکتور بیانی (+) pET28a
انتقال قطعه ژنی HrpE به پلاسمید بیانی (+) pET28a بهصورت زیر انجام شد. برای این منظور سازههای pTZ57R/T-HrpE و (+) pET28a بهصورت جداگانه با آنزیم برشی Xho1/Sal1 برش داده شدند. پس از جداسازی، قطعه مربوطه از روی ژل آگارز خالصسازی و الحاق قطعه ژنی HrpE در ناحیه پایینی توالی تکرار ششتایی هیستیدین ناقل بیانی با استفاده از واکنش آنزیمیT4 DNA ligase صورت پذیرفت و سازه pET28a-HrpE به روش شوک حرارتی به سویه E.coli DH5α وارد شد (Sambrook et al., 1996).
بررسی بیان پروتئین نوترکیب
جهت بررسی بیان ژن تولیدکننده پیلوس در میزبان باکتریایی، بیان ژن در شرایط مختلف دمایی و تحت غلظتهای مختلف 5/0 و یک میلیمولار IPTG و در زمانهای 3، 6 و 16 ساعت مورد بررسی قرار گرفت (Sadeghi et al., 2011). به منظور ارزیابی میزان بیان ژن HrpE در باکتری در حالات مختلف بیانی، از روش SDS-PAGE استفاده شد. برای این منظور ژل پلی اکریل آمید 12% مورد استفاده قرار گرفت و در نهایت به روش کوماسی بلو رنگآمیزی شد (Surendran et al., 2015).
خالصسازی پروتئین نوترکیب
خالصسازی پروتئین نوترکیب پس از بهینهسازی شرایط بیان و تحت شرایط طبیعی با استفاده از ستون آگارز حاوی یونهای نیکل صورت پذیرفت. برای این منظور، ابتدا کلنی باکتری E.coli سویه Rosetta حاوی سازه pET28a-HrpE در محیط کشت مایع LB حاوی آنتیبیوتیک کانامیسین (50 میکروگرم در میلی لیتر) به مدت 3-2 ساعت کشت شد تا جذب نوری (OD 600nm) آن به 4/0 برسد. به منظور القاء باکتری برای تولید پروتئین نوترکیب، IPTG با غلظت نهایی یک میلیمولار اضافه شد و محیط کشت به مدت 16 ساعت در دمای 30 درجه سلسیوس و در انکوباتور با250 دور در دقیقه قرار داده شد. پس از گذشت زمان مورد نظر، جداسازی سلولهای باکتریایی با انجام سانتریفیوژ در 4000 دور در دقیقه به مدت 20 دقیقه انجام شد. رسوب بهصورت شبانه در 20- درجه سلسیوس نگهداری شد. معلقسازی رسوب با استفاده از بافر لیزکننده صورت گرفت و تخریب دیواره سلولی باکتری با استفاده از امواج صوتی اولتراسونیک با توان 200 وات به تعداد هفت دوره 10 ثانیه ای با فواصل میانی 10 ثانیه، بر روی یخ صورت گرفت. سلولهای تخریب شده به مدت 30 دقیقه در سانتریفیوژ یخچال دار با دمای 4 درجه سلسیوس و با دور 10000 دور در دقیقه سانتریفیوژ شدند و محلول رویی جهت استفاده در ستون دارای رزین نیکل (Ni2+) جداسازی شد. با توجه به اینکه قطعه ژنی کلون شده در انتهای آمینی خود دارای دنباله شش تایی هیستیدین [2] است، پروتئین بیان شده HrpE همراه با این دنباله است و میتوان آن را توسط کروماتوگرافی و با استفاده از ستون دارای رزین نیکل (Ni2+) تخلیص کرد ( Shahryari et al., 2013). تأیید مرحله بیان و خالصسازی پروتئین توسط ژل پلیاکریلآمید و همچنین آزمون وسترن بلاتینگ انجام شد (Ausubel et al., 1995). بهمنظور ردیابی پروتئین نوترکیب متصل به His-tag از پادتن اولیه anti His-tag و سپس پادتن ثانویه GAMAP استفاده شد. ظهور باندهای اختصاصی مربوط به پروتئین نوترکیب متصل به ترادف شش تایی هیستیدین با افزودن سوبسترای نیتروبلوتترازولیوم [3](BCIP/NBT) صورت پذیرفت.
نتایج و بحث
با توجه به نقش حیاتی و مهمی که پیلوس در پروسهی بیماری شانکر دارد، جداسازی و تکثیر قطعه ژن کدکننده زیر واحدهای این ملکول انجام شد. پس از استخراج DNA از کلنیهای رشدیافته، واکنش زنجیرهای پلیمراز با استفاده از آغازگرهای اختصاصی ژن HrpE انجام شد. باند مربوط به ژن تکثیر شده بر روی ژل آگارز یک درصد بررسی شد. نتایج حاصله حاکی از جداسازی و تکثیر قطعهای در حدود 282 جفت باز بود. اندازهی قطعه از طریق مقایسه با مارکر ملکولی استاندارد تائید شد (شکل1- الف).
قطعه ژنی تکثیر یافته ﻣﺮﺑﻮﻃﻪ ﺍﺯ ﺭﻭﻱ ژﻝ ﺁﮔﺎﺭﻭﺯ ﺟﺪﺍﺳﺎﺯﻱ ﻭ ﺩﺭ ﻧﺎﻗﻞ pTZ57R/T ﻫﻤﺴﺎﻧﻪﺳﺎﺯﻱ شد. ﺑﻪ ﻣﻨﻈﻮﺭ ﺑﺮﺭﺳﻲ ﺻﺤﺖ ﻓﺮﺍﻳﻨﺪ همسانهسازی، تعیین ترادف انجام و مورد تأیید قرار گرفت. همترازی ترادف مذکور با توالیهای موجود در بانک اطلاعاتی ژن NCBI، حاکی از وجود تشابه بسیار بالا (100-95 درصد) ﺩﺭ ﺗﺮﺍﺩﻑ ﺍﻳﻦ ﻗﻄﻌﻪ ژﻧﻲ ﺩﺭ ﺳﻮﻳﻪﻫﺎ ﻭ ﻳﺎ ﺣﺘﻲ ﮔﻮﻧﻪﻫﺎﻱ ﻣﺨﺘﻠﻒ ﺯﺍﻧﺘاﻣﻮﻧﺎﺱ بود. ﺍﻳﻦ ﺗﺸﺎﺑﻪ ﺑﻪ ﺩﻟﻴﻞ ﺍﻫﻤﻴﺖ ﻭﺟﻮﺩ ﺳﺎﺧﺘﺎﺭ ﻣﺤﺎﻓﻈﺖ ﺷﺪﻩ ﺍﻳﻦ ﭘﺮﻭﺗﺌﻴﻦ ﺑﺮﺍﻱ ﺍﻳﻔﺎﻱ ﻧﻘﺶ ﺍﺳﺎﺳﻲ ﺁﻥ ﺩﺭ ﻓﺮﺍﻳﻨﺪ انتقال ﭘﺮﻭﺗﺌﻴﻦ ﺍﻓﻜﺘﻮﺭ و ﺑﻴﻤﺎﺭﻱﺯﺍﻳﻲ ﻣﻲباشد (Shiotani et al., 2007; Nino-Liu et al., 2006).
انتقال قطعه ژنی HrpE به ناقل بیانی pET28a(+) با انجام واکنش هضم آنزیمی (شکل1- ب) و الحاق مجدد توسط آنزیم T4 صورت پذیرفت. ناقل بیانی pET28a(+) به منظور تولید پروتئین نوترکیب در ﻣﻴﺰﺑﺎﻥ ﺑﺎﻛﺘﺮﻳﺎﻳﻲ ﻣﻮﺭﺩ ﺍﺳﺘﻔﺎﺩﻩ ﻗﺮﺍﺭ گرفت. ﺍﻳﻦ ﭘﻼﺳﻤﻴﺪ ﺩﺍﺭﺍﻱ ﺗﺮﺍﺩﻑﻫﺎﻱ ﻛﺪ ﻛﻨﻨﺪﻩ ﺩﻧﺒﺎﻟﻪ هیستیدین ﻣﻲﺑﺎﺷﺪ، وجود این ترادف باعث تسهیل فرآیند خالصسازی پروتئین نوترکیب با استفاده از ﺳﺘﻮﻥ ﺁﮔﺎﺭﻭﺯ ﺣﺎﻭﻱ ﺫﺭﺍﺕ ﻧﻴﻜﻞ میشود (Berlec et al., 2006). تأیید فرآیند همسانهسازی با انجام آزمونهای کلنی PCR و هضم آنزیمی مجدد صورت پذیرفت.
پس از انتقال پلاسمید نوترکیب pET28a-HrpE به سویه بیانی Rosetta باکتری E.coli، تولید پروتئین توسط IPTG بررسی شد. در طی مراحل مختلف بیان و خالصسازی پروتئین، ﻧﻤﻮﻧﻪﻫﺎﻳﻲ ﺑﺮﺩﺍﺷﺖ شدﻩ ﻭ ﺍﻳﻦ ﺭﻭﻧﺪ ﺑﺎ ﺍﻧﺠﺎﻡ ﺍﻟﻜﺘﺮﻭﻓﻮﺭﺯ ﭘﺮﻭﺗﺌﻴﻦ مورد ارزیابی قرار گرفت (شکل2- الف). با توجه به نتایج پروتئین در وزنی حدود 26 کیلو دالتون مشاهده شد که مطابق با وزن پیشبینی شده بود. نتایج مربوطه نشان داد که بهترین زمان القاء توسط IPTG برای بالاترین میزان بیان پروتئین، 16 ساعت و غلظت یک میلی مولار از IPTG بود.
در خصوص تولید پروتئین HrpE در E.coli به نظر میرسد که با توجه به تشابه نوع ﻣﻴﺰﺑﺎﻥ ﻛﻪ ﻫﺮ ﺩﻭ ﭘﺮﻭﻛﺎﺭﻳﻮت هستند، ﻣﺸﻜﻞ ﺧﺎﺻﻲ ﺩﺭ ﺑﻴﺎﻥ ژﻥ ﻣﺮﺑﻮﻃﻪ ﺍﻳﺠﺎﺩ ﻧشد.
شکل 1- الف:تکثیر ژن HrpE به کمک واکنش PCR و مشاهده آن بر روی ژل آگارز یک درصد. چاهک 1: مارکر (DNA Ladder Mix) ، چاهک2: ژن HrpE با طول تقریبی حدود 300 جفت باز. ب: هضم آنزیمی به منظور جداسازی قطعه ژنی HrpE از پلاسمید pTZ57R/T دارای این قطعه ژنی. چاهک 1: مارکر (DNA Ladder Mix) ؛ چاهک 2 و3: واکنش هضم آنزیمی پلاسمید pET28a؛ چاهک 4 و5: واکنش هضم آنزیمی پلاسمید pTZ57R/T دارای قطعه ژنی HrpE و جداسازی قطعه HrpE.
Figure 1- A: Amplification of HrpE gene and its PCR product on 1% (w/v) agarose gel Lane 1: DNA Ladder Mix, lane 2: HrpE gene with length around 300 bp. B: Isolation of HrpE gene from pTZ57R/T- HrpE by double digestion of construct (Lane 1: DNA Ladder Mix, lane 2,3: double digestion of pET28a, lane 4,5: Double digestion of pTZ57R/T-pthA for isolation of HrpE gene.
بنابراین، با توجه به نقش حیاتی این ﻗﺴﻤﺖ ﺍﺯ ﭘﺮﻭﺗﺌﻴﻦ ﺩﺭ ﻓﺮآﻳﻨﺪ ﺑﻴﻤﺎﺭﻱﺯﺍﻳﻲ، ﺗﻮﻟﻴﺪ ﻭ ﺧﺎﻟﺺ ﺳﺎﺯﻱ ﺍﻳﻦ ﻗﺴﻤﺖ ﺑﻪ ﻣﻨﻈﻮﺭ ﺗﻬﻴﻪ ﺁﻧﺘﻲﺑﺎﺩﻱﻫﺎﻱ ﺍﺧﺘﺼﺎﺻﻲ ﺻﻮﺭﺕ ﭘﺬﻳﺮﻓﺖ.
ﭘﺲ ﺍﺯ ﺗﺨﺮﻳﺐ ﺳﻠﻮﻝﻫﺎﻱ ﺑﺎﻛﺘﺮﻱ ﻭ ﺁﺯﺍﺩﺳﺎﺯﻱ ﭘﺮﻭﺗﺌﻴﻦﻫﺎﻱ ﺳﻠﻮﻟﻲ، ﺟﺪﺍﺳﺎﺯﻱ ﻭ ﺧﺎﻟﺺﺳﺎﺯﻱ ﭘﺮﻭﺗﺌﻴﻦ ﻧﻮﺗﺮﻛﻴﺐ ﻣﺘﺼﻞ ﺑﻪ ﺩﻧﺒﺎﻟﻪ ﻫﻴﺴﺘﻴﺪﻳﻦ ﺑﺎ ﺍﺳﺘﻔﺎﺩﻩ ﺍﺯ ﺳﺘﻮﻥ ﺁﮔﺎﺭﻭﺯ ﺣﺎﻭﻱ ﺫﺭﺍﺕ ﻧﻴﻜﻞ ﺻﻮﺭﺕ ﭘﺬﻳﺮﻓﺖ. ﻧﺘﺎﻳﺞ ﺑﻴﺎﻥ ﻭ ﺧﺎﻟﺺسازی ﺣﺎﻛﻲ ﺍﺯ ﺑﻴﺎﻥ ﭘﺮﻭﺗﺌﻴﻦ ﻧﻮﺗﺮﻛﻴﺐ HrpE ﺩﺭ ﻣﻴﺰﺑﺎﻥ ﺑﺎﻛﺘﺮﻳﺎﻳﻲ ﻭ ﺧﻠﻮﺹ ﺑﺎﻻﻱ ﺁﻥ ﺩﺭ ﻧﻤﻮﻧﻪ ﺧﺎﻟﺺ ﺷﺪﻩ است (شکل2- ب).
ﺑﺎ ﻣﻘﺎﻳﺴﻪ ﺑﺎﻧﺪ ﭘﺮﻭﺗﺌﻴﻦ ﺧﺎﻟﺺ ﺑﺎ ﺑﺎﻧﺪﻫﺎﻱ ﻣﻮﺟﻮﺩ ﺩﺭ ﻧﺸﺎﻧﮕﺮ ﭘﺮﻭﺗﺌﻴﻦ، ﻭﺯﻥ ﭘﺮﻭﺗﺌﻴﻦ نوترکیب در حدود 26 کیلو دالتون تعیین شد که از این مقدار 2/23 مربوط به پروتئین اصلی و مابقی مربوط به دنباله متصل به پروتئین ناشی از پلاسمید بیانی است.
نتایج ردیابی پروتئین نوترکیب با استفاده از پادتن علیه His-tag در مجاورت کنترل منفی و با روش وسترن بلاتینگ، نشان داد که پروتئین نوترکیب HrpE با موفقیت تولید و تخلیص شد (شکل 3).
بیان ژن هترولوگوس در باکتری رایج‌ترین سیستم بیانی استفاده شده برای تولید سطح بالایی از پروتئینهای نوترکیب برای امور تحقیقاتی و تجاری میباشد. E. coli متداول ترین میزبانی است که برای بیان بسیاری از پروتئینهای نوترکیب استفاده میشود. از جمله مزایایی این سیستم بیانی تکثیر سریع، میزان بالای بیان پروتئین نوترکیب و قدرت
بالا جهت پذیرش ژن‌های بیگانه میباشد (Rosano & Ceccarelli, 2014; Ariannejad et al., 2012).
این سیستمها تولید انبوه پروتئین متصل به دنباله هیستیدین و خالص سازی آن به وسیله کروماتوگرافی میل ترکیبی در شرایط طبیعی را تسهیل میکنند (Berlec et al., 2005; Fu et al., 2007). موارد متعددی از استفاده از این سیستم جهت بیان ژن‌های خارجی در میزبان باکتریایی برای تولید پروتئین نوترکیب گزارش شده است (Perrie et al., 2008; Khatabi et al., 2012; Safarpur et al., 2012; Shahryari et al., 2013; Thaitrong et al., 2013).
در این تحقیق جهت تولید پروتئین نوترکیب از سازههای pET28a-HrpE استفاده شد که تحت کنترل پروموتر قدرتمند T7 بوده و تولید پروتئین با غلظت بالا در این سیستم صورت میپذیرد (Nanni et al., 2013). بیان ژن در سازههای مورد نظر در سویهRosseta باکتری E. coli صورت پذیرفت. بیان انواع پروتئینها در سویه Rosseta به دلیل داشتن tRNA های برای کدونهای نادر امکان پذیر است و در نتیجه این سویه دارای توانایی تولید پروتئین نوترکیب با کارایی و میزان بیان بالاتر نسبت به سایر سویههای بیانی مانند سویه BL21 است (Tegel et al., 2010; Rosano & Ceccarelli, 2014).
در این تحقیق برای اولین بار ژن HrpE از سویه ایجاد کننده فرم A* بیماریی شانکر مرکبات جداسازی، بیان و خالصسازی گردید. سیستم تخلیص پروتئین نشان دهنده خلوص بالای پروتئین بود که در صورت استفاده از پروتئین به عنوان آنتی ژن از اهمیت بسیار بالایی برخوردار است، زیرا از مراحل کلیدی در طراحی روشهای تشخیص بیماریهای گیاهی، تخلیص آنتیژن است. پروتئینهای ضروری در بیماری‌زایی عامل بیمارگر از گزینههایی هستند که به عنوان آنتیژنهای ایمنیزا و محافظتی شناخته شدهاند. از آنتیژن خالصسازی شده میتوان در تولید آنتیبادی علیه بیمارگر در گیاه استفاده کرد.
شکل 2- الف: بررسی بیان ژن HrpE در شرایط مختلف القایی بر روی ژل SDS-PAGE (چاهک 1: نمونه قبل از القاء؛ چاهک 2: میزان بیان سه ساعت پس از القا با IPTG 1 میلی مولار؛ چاهک 3: نشانگر پروتئینی 1170 کیلو دالتون؛ چاهک 4: بیان شش ساعت پس از القا با IPTG 1 میلی مولار؛ چاهک 5: بیان 16 ساعت پس از القا با IPTG 5/0 میلی مولار؛ چاهک 6: بیان 16ساعت پس از القا با IPTG 1 میلی مولار). ب: ﺧﺎﻟﺺﺳﺎﺯﻱ ﭘﺮﻭﺗﺌﻴﻦ ﺍﻓﻜﺘﻮﺭ ﺑﻪ ﺻﻮﺭﺕ ﻧﻮﺗﺮﻛﻴﺐ ﻣﺘﺼﻞ ﺑﻪ ﺩﻧﺒﺎﻟﻪ ﺷﺶﺗﺎﻳﻲ ﻫﻴﺴﺘﻴﺪﻳﻦ ﺑﺮ روی ستون نیکل (چاهک 1: نمونه قبل از القا با IPTG؛ چاهک 2: نمونه بعد از القا با IPTG یک میلی مولار؛ چاهک 3: مرحله شستشو؛ چاهک 4، 5، 6 ،7 و 9: پروتئین تخلیص شده HrpE با وزن 27 کیلو دالتون؛ چاهک 8: نشانگر وزن ملکولی پروتئین).
Figure 2- A: SDS-PAGE analysis of HrpE expression in different IPTG concentrations and induction period. Proteins were analyzed by (Lane 1: uninduced cells, lane 2: 3 h post induction at 1 mM IPTG, Lane 3: 170 kDa protein marker; lane 4: 6 h post induction at 1 mM IPTG, Lane 5: 16 hpost induction at 0.5 mM IPTG, Lane 6: 16 h post induction by 1 mM IPTG). B: Purification of efector protein as fussed to 6×-His tag on nickel column (Lane 1: uninduced cells by IPTG, Lane 2: induction by 1 mM IPTG, Lane 3: washing stage , Lane 4, 5, 6,7 and 9: Purified HrpE protein with molecular weight around 27 kDa, Lane 8: protein molecular ladder).
شکل 3- آزمون وسترن بلات با استفاده از پادتن اختصاصی دنباله هیستیدین (چاهک1، 2 و 4: بیان قطعه ژنی HrpE بعد القا با IPTG 1 میلی مولار؛ چاهک 3: نشانگر پروتئینی؛ چاهک 5: نمونه قبل از افزودن IPTG).
Figure 3- Western analysis by applying anti his-tag antibody (Lane 1, 2 and 4: HrpE expression after induction by 1 mM IPTG, lane 3: prestained marker, Lane 5: non-induced cells by IPTG).
با توجه به این که بیان آنتیبادی در گیاه یک ابزار قوی برای سرکوب بیمارگرهای گیاهی است، تولید و بیان پادتن علیه پروتئینهای ضروری بیمارگر و انتقال قطعات پادتن تولید شده به گیاه روش مناسبی جهت بیان پادتن در گیاه و در نتیجه سرکوب بیماری است (Le Gall et al, 1998; Fischer et al., 2001; Huang et al., 2011; Shahryari et al., 2013). در نتیجه با توجه به دارا بودن خصوصیت آنتیژنی پروتئین نوترکیب HrpE تولیدی، میتوان از طریق پادتن تک همسانهای نوترکیب (recombinant monoclonal antibodies) بر علیه این پروتئین، مانع از تشکیل پیلوس شد و در نتیجه مانع انتقال افکتور پروتیئن به داخل سیتوسل سلول گیاهی و ایجاد بیماری شد که این هدف به منظور ایجاد مقاومت بر علیه بیماری با استراتژی مقاومت وابسته به پلنتیبادی مورد استفاده قرار میگیرد.
منابع
Alizadeh A, Rahimian H (1990). Citrus canker in Kerman province. Iran Journal Plant Pathology 26: 42 (In Persian).
Ariannejad H, Nassiri MR, Aslaminejad A, Tahmoorespour M, Valizadeh R, Asoodeh A, Ghovvati S (2012). Cloning, nucleotide characterization and modeling expression of phytase gene phyC from Bacillus subtilis. Journal of Agricultural Biotechnology 4: 19-33 (In Persian).
Ausubel F, Brent R, Kingstone R, Moore D, Seidman JG, smith JA, Struhl K (1995). Current Protocols in Molecular Biology, New York, Wiley Interscience, 4648 Pp.
Berlec A, Jevnikar Z, Majhenic AC, Rogelj I, Strukelj B (2006). Expression of the sweettasting plant protein brazzein in Escherichia coli and Lactococcus lactis: a path toward sweet lactic acid bacteria. Applied Microbiology and Biotechnology 73: 158-165.
Buttner D, Yang H (2009). Type ΙΙΙ protein secretion in plant pathogenic bacteria. Plant Physiology 150: 1656-1664.
Cornelis GR, Gijsegem FV (2000). Assembly and function of type III secretory systems. Annual Review of Microbiology 54: 735-774.
Duan YP, Castaneda AL, Zhao G, Erdos G, Gabriel DW (1999). Expression of a single, host-specific, bacterial pathogenicity gene in plant cells elicits division, enlargement and cell death. Molecular. Plant Microbe Interaction 12: 556 – 560.
Ebrahimi Y (2009). Citrus situation in Iran. Ministry of Jihad e Agriculture. pP39. (In Farsi)
Fao (2014). FAOSTAT, production, from http://www.fao.org.
Fischer R, Emans N, Schillberg S (2001). Achieving plant disease resistance by antibody expression. Canadian Journal Plant Pathology 23: 236–45.
Fu W, Lin J, Cen P (2007). 5-Aminolevulinate production with recombinant Escherichia coli using a rare codon optimizer host strain. Applied Microbiology and Biotechnology 75: 777-782.
Gottwald TR, Graham JH, Schubert TS (2002). Citrus Canker: The pathogen and its impact. Plant Health Progress DOI:10.1094/PHP-2002-0812-01-RV.
Graham JH, Gottwald TR, Cubero J, Achor D (2004). Xanthomonas axonopodus pv. citri: Factors affecting successful eradication of citrus canker. Molecular Plant Pathology 5: 1-15.
Huang J, Ru B, Dai P (2011). Bioinformatics resources and tools for phage display. Molecules 16: 694–709.
Khatabi B, He B, Hajimorad MR (2012). Diagnostic potential of polyclonal antibodies against bacterially expressed recombinant coat protein of Alfalfa mosaic virus. Plant Disease 96: 1352-1357.
Khodakaramian G, Rahimian H, Mohamadi M, Alameh A (1999). Phenotypic features, host range and distribution of the strains Xanthomonas axonopodis including citrus canker in southern Iran. Iranian Journal of Plant Pathology 35: 102-111. (In Persian with English summary).
Koebnik R (2005). The type III-dependent Hrp pilus is required for productive interaction of Xanthomonas campestris pv.vesicatoria with pepper host plants. Journal of Bacteriology 187: 24587.
Le Gall F, Bove JM, Garnier M (1998). Engineering of a single-chain variable-fragment (scFv) antibody specific for the stolbur phytoplasma (Mollicute) and its expression in Escherichia coli and tobacco plants. Applied and Environmental Microbiology 64: 4566–72.
Mokhtari M, Safarnejad MR, Alavi SM, Torkamanzehi A (2015). Isolation, gene expression and PthA effector protein production of Xanthomonas citri subsp citri causal agent of citrus bacterial canker. Journal of Agricultural Biotechnology 7(2): 155-170 (In Persian).
Nanni V, Bertolini P, Baraldi E, Zanetti M, Dalla Serra M, Bellucci M, Mose C (2013). Peach (Prunus persica) defensin PPDFN1 displays antimicrobial activity against fungal pathogens through specific lipid binding and membrane permeabilization. Acta horticulturae 1012: 699-704
Nino-liu DO, Ronald PC, Bogdanove AJ (2006). Xanthomonas oryzae pathovars: model pathogens of a model crop. Molecular Plant Pathology 7: 303-324.
Perrie Y, Mohammed AR, Kirby DJ, McNeil SE, Bramwell VW (2008). Vaccine adjuvant systems: enhancing the efficacy of sub-unit protein antigens. International Journal of Pharmaceutics 364:272–280.
Roohani R, Soltani Najafabadi M, Alavi SM, Farrokhi N, Shamsbakhsh M (2012). Transcript analysis of some pathogenicity-related elements in an Iranian A* isolate of Xanthomonas citri subsp. citri. Journal Crop Protection 1 (4): 337-347.
Rosano GL, Ceccarelli EA (2014). Recombinant protein expression in Escherichia coli: advances and challenges. Frontiers in Microbiology 5: 172.
Sadeghi HMM, Rabbani M, Rismani E, Moazen F, Khodabakhsh F, Dormiani K, Khazaei Y (2011). Optimization of the expression of reteplase in Escherichia coli. Research in Pharmaceutical Sciences 6: 87–92.
Safarnejad MR, Salehi Jouzani GR, Tabatabaie M, Twyman RM, Schillberg S (2011). Antibody-mediated resistance against plant pathogens. Biotechnology Advances 29: 961-971.
Safarpur H, Safarnejad MR, Tabatabaei M, Mohsenifar A (2012). Developing of nanobiosensor
based high-throughput screening for evaluation of sugar beet germlines against Polymyxa betae. Communication in Applied Biological Science 77: 7-14.
Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T (1996). Molecular Cloning - A Laboratory Manual. New York: Cold Spring Harbor Laboratory.
Schaad NW, Postnikova E, Lacy GH, Sechler A, Agarkova I, Stromberg PE, Stromberg VK, Vidaver AK (2005). Reclassification of Xanthomonas campestris pv. citri (ex Hasse 1915) Dye 1978 forms A, B/C/D, and E as X. smithii subsp. citri (ex Hasse) sp. nov. nom. rev. comb. nov., X. fuscans subsp. aurantifolii (ex Gabriel 1989) sp. nov. nom. rev. comb. nov., and X. alfalfae subsp. citrumelo (ex Riker and Jones) Gabriel et al., 1989 sp. nov. nom. rev.comb. nov.; X. campestris pv. malvacearum (ex Smith, 1901) Dye 1978 as X. smithii subsp. smithii nov. comb. nov. nom. nov.; X. campestris pv. alfalfae (ex Riker and Jones, 1935) Dye 1978 as X. alfalfae subsp. alfalfae (ex Riker et al., 1935) sp. nov. nom. rev.; and ‘‘var. fuscans’’ of X. campestris pv. phaseoli (ex Smith, 1987) Dye 1978 as X. fuscans subsp. fuscans sp. nov. Systematic and Applied Microbiology 28: 494–518.
Schaad NW, Postnikova E, Lacy G, Sechler A, Agarkova I, Stormberg PE, Stormberg VK, Vidaver AK (2006). Emended classification of Xanthomonad pathogens on citrus. Systemaic and Applied Microbiology 29: 690–695.
Schoulties CL, Civerolo EL, Miller JW, Stall RE, Krass CJ (1987). Citrus canker in Florida. Plant Disease 71: 388-395.
Shahryari F, Shams-Bakhsh M, Safarnejad MR, Safaiee N, Ataie Kachoiee S (2013). Preparation of polyclonal antibody against Immunodominant membrane protein (IMP) of Candidatus Phytoplasma aurantifolia. Iranian Journal of Biotechnology 11: 14-21.
Shahryari F, Shams-Bakhsh M, Safarnejad MR, Safaiee N, Ataie Kachoiee S (2013). Preparation of polyclonal antibody against Immunodominant membrane protein (IMP) of Candidatus Phytoplasma aurantifolia. Iranian Journal of Biotechnology 11: 14-21.
Shiotani H, Fujikawa T, Ishihara H, Tsuyumu S, Ozaki K (2007). A pthA homolog from Xanthomonas axonopodis pv. citri responsible for host-specific suppression of virulence. Journal of Bacteriology 189: 3271-3279.
Swarup S, Yang Y, Kingsley MT, Gabriel DW (1992). An Xanthomonas citri pathogenicity gene, pthA, pleiotropically encodes gratuitous avirulence on nonhosts. Molecular. Plant Microbe Interaction 5: 204–213.
Tegel H, Tourle S, Ottosson J, Persson A (2010). Increased levels of recombinant human proteins with the Escherichia coli strain Rosetta (DE3). Protein Expression and Purification 69:159-167.
Thaitrong N, Charlermroj R, Himananto O, Seepiban C, Karoonuthaisiri N (2013). Implementation of Microfluidic Sandwich ELISA for Superior Detection of Plant Pathogens. PLoS ONE 8:1-9.
Weber E, Ojanen-Reuhs T, Huguet E, Hause G, Romantschuk M, Korhonen TK, Bonas U, Koebnik R (2005). The type III-dependent Hrp pilus is required for productive interaction of Xanthomonas campestris pv.vesicatoria with pepper host plants. Journal of Bacteriology 187: 2458-2468.
Gene cloning and expression of Xanthomonas citri subsp. citri pilin
Raeisi H.1, Safarnejad M.R.*2, Alavi S.M.3, Elahinia S.A.1, Farokhi N.4
1Ph.D. Student of Plant Pathology, College of Agricultural Sciences, Guilan University, Rasht, Iran.
2Associate Professor of Department of Plant Viruses, Iranian Research Institute of Plant Protection, Agricultural Research Education and Extension Organization of Iran. Tehran, Iran.
3 Assistant Professor of Department of Plant Biotechnology, National Institute of Genetic Engineering and Biotechnology, Tehran, Iran.
4 Professor of Department of Plant Protection, College of Agricultural Sciences, Guilan University, Rasht, Iran.
5Assistant Professor of Department of Plant Sciences & Biotechnology, Faculty of Life Sciences & Biotechnology, Shahid Beheshti University, Tehran, Iran.
Abstract
Citrus bacterial canker is a disease caused by Xanthomonas citri subsp. citri (Xcc). The bacterial type III secretion system (TTSS) consist of an extracellular filamentous structure mediating transfer of bacterial proteins into the plant cytosols. The main part of the pilus is pilin protein (HrpE) that is encoded by the HrpE gene. Production of specific antibodies against the pilin protein can be implemented for detection of infected plants as well as to develop a source of genetic resistance against disease. Inhibition of HrpE protein through antibody therapy leads to suppression of disease in the plant. The objective of the present study was to isolate, clone and express the HrpE gene. To do this, the HrpE gene was amplified by PCR using gene-specific primers and cloned to the pTZ57R/T vector. Then, it was cloned to the pET28a(+) bacterial expression vector and expressed in the E. coli strain Rosetta as host. The protein production procedure was optimized for incubation time and temperature as well as the concentration of inducer. The greatest amount of the recombinant protein was yielded at 1 mM IPTG at 30° C for 16 h. Purification of HrpE recombinant protein was done via metal affinity chromatography. The results of both SDS-PAGE and Western blotting assays confirmed the expression accuracy and purity of recombinant pilin protein. The recombinant protein can be used as an antigen to develop monoclonal and polyclonal antibodies.
Keywords: Citrus bacterial canker, Xanthomonas citri subsp. citri, recombinant protein, type III secretion system(TTSS), HrpE, pilus.
)
