کاربرد الگوریتم uMelt SM در آنالیز منحنی ذوب Real-time PCR

نوع مقاله : مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 دانش آموخته کارشناسی ارشد بیوتکنولوژی کشاورزی، گروه علوم گیاهی و بیوتکنولوژی، دانشکده علوم و فناوری زیستی، دانشگاه شهید بهشتی، تهران، ایران.

2 هیئت علمی موسسه ملی گیاهان زینتی (NIOP)، تحقیقات باغبانی علوم، تحقیقات کشاورزی، آموزش و توسعه، محلات، ایران.

چکیده

یکی از چالش­های موجود در تفسیر نتایج qPCR ، اطمینان از اختصاصی بودن قطعات تکثیر شده است که برای بررسی آن از آنالیز منحنی ذوب استفاده می­شود. پیک­های اضافی در منحنی ذوب همیشه نشان دهنده یک مشکل نیست، به همین منظور در این مقاله یک ابزار مبتنی بر وب به نام uMelt SM به عنوان راهکاری کاربردی و ساده برای آنالیز صحیح منحنی ذوب به محققین پیشنهاد می­گردد که امکان پیش­بینی منحنی ذوب DNA و پروفیل­های واسرشته سازی را با وضوح بالای فلورسنت از محصولات PCR فراهم می­کند. نتایج این مطالعه نشان داد که منحنی­های ذوب براساس چه پارامترهایی تولید شده و الگوریتم مناسب برای نحوه کار با این نرم افزار ارائه گردید. در نهایت ژن­های اکتین و سوپراکسید دیسموتاز از قارچ  Pyricularia oryzae به عنوان الگوی مناسب برای تعیین منحنی پیش­بینی شده با استفاده از این نرم­افزار ارائه گردید و منحنی Real-time PCR نیز ترسیم شد. براساس نتایج منحنی ذوب با استفاده از نرم افزار uMelt SM در مقایسه با منحنی ذوب دستگاه Real-Time PCR تطابق بالایی را نشان می­دهد که این نتایج تأییدی بر مزیت­هایی همچون سهولت استفاده، صرفه­جویی در زمان، هزینه و تلاش در بخش تجربی با استفاده از این نرم­افزار می­باشد.

کلیدواژه‌ها


عنوان مقاله [English]

Application of uMelt SM algorithm in Real-time PCR melting curve analysis

نویسندگان [English]

  • Anahita Kharabi 1
  • Abbas Saedi 2
1 MSc of Agricultural Biotechnology, Department of Plant Sciences and Biotechnology, Faculty of Life Sciences and Biotechnology, Shahid Beheshti University, G.C. Velenjak, Tehran, Iran.
2 Scientific Board of National Institute of Ornamental Plants (NIOP), Research Horticultural Science, Agricultural Research, Education and Extension Organization(AREEO), Mahallat, Iran.
چکیده [English]

One of the challenges in interpreting the results obtained in qPCR is to make sure the amplicons are specific and that the melting curve analysis is used to examine it.  Additional peaks in the melting curve is not always indicative of a problem, for this purpose, in this paper, a web-based tool called uMelt SM is suggested to researchers as a practical and simple way for the correct analysis of the melting curve which provides the possibility of predicting the DNA melting curve and denaturation profiles of the high-fluorescence resolution of PCR products. The results of this study showed that the melting curves were generated based on parameters were generated and an appropriate algorithm for working with this software was presented.  Finally, actin and superoxide dismutase genes from Pyricularia oryzae were presented as a suitable model for determining the predicted curve using this software and Real-Time PCR curve was also drawn.  Results of the uMelt SM predicted melting curves showed a high degree of compliance with the real-time PCR melting curves, which confirms the advantages of ease of use, saving time, cost, and effort in the experimentalist part when using uMelt SM software.

کلیدواژه‌ها [English]

  • qPCR
  • melting curve
  • experiment
  • predict
  • uMeltSM

کاربرد الگوریتم uMelt SM در آنالیز منحنی ذوب Real-time PCR

 

اناهیتا خارابی ماسوله1، عباس سعیدی2*

 

1 دانش آموخته کارشناسی ارشد بیوتکنولوژی کشاورزی، گروه علوم گیاهی و بیوتکنولوژی، دانشکده علوم و فناوری زیستی، دانشگاه شهید بهشتی، تهران، ایران.

2 استاد گروه علوم گیاهی و بیوتکنولوژی، دانشکده علوم و فناوری زیستی، دانشگاه شهید بهشتی، تهران، ایران.

 

تاریخ دریافت: 26/09/1396، تاریخ پذیرش: 07/02/1397

 

چکیده

یکی از چالش­های موجود در تفسیر نتایج qPCR ، اطمینان از اختصاصی بودن قطعات تکثیر شده است که برای بررسی آن از آنالیز منحنی ذوب استفاده می­شود. پیک­های اضافی در منحنی ذوب همیشه نشان دهنده یک مشکل نیست، به همین منظور در این مقاله یک ابزار مبتنی بر وب به نام uMelt SM به عنوان راهکاری کاربردی و ساده برای آنالیز صحیح منحنی ذوب به محققین پیشنهاد می­گردد که امکان پیش­بینی منحنی ذوب DNA و پروفیل­های واسرشته سازی را با وضوح بالای فلورسنت از محصولات PCR فراهم می­کند. نتایج این مطالعه نشان داد که منحنی­های ذوب براساس چه پارامترهایی تولید شده و الگوریتم مناسب برای نحوه کار با این نرم افزار ارائه گردید. در نهایت ژن­های اکتین و سوپراکسید دیسموتاز از قارچ  Pyricularia oryzae به عنوان الگوی مناسب برای تعیین منحنی پیش­بینی شده با استفاده از این نرم­افزار ارائه گردید و منحنی Real-time PCR نیز ترسیم شد. براساس نتایج منحنی ذوب با استفاده از نرم افزار uMelt SM در مقایسه با منحنی ذوب دستگاه Real-Time PCR تطابق بالایی را نشان می­دهد که این نتایج تأییدی بر مزیت­هایی همچون سهولت استفاده، صرفه­جویی در زمان، هزینه و تلاش در بخش تجربی با استفاده از این نرم­افزار می­باشد.

واژه­های کلیدی: qPCR، منحنی ذوب، آزمایش، پیش بینی،uMelt SM.

 


مقدمه

 

واکنش زنجیره­ای پلیمراز کمی ((qPCR، یک روش آزمایشگاهی زیست شناسی مولکولی بوده که بر اساس واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR) شناخته می­شود. از جمله مزایای Real-Time PCR ترسیم منحنی ذوب است که این عمل پس از اتمام فرآیند PCR  انجام می­شود. این منحنی در سال 1997 به عنوان جایگزینی برای الکتروفورز ژل برای ارزیابی خلوص محصول معرفی شد (Ririe et al., 1997). دمای ذوبDNA  پارامتر ویژه‌ای از این مولکول بوده و به ساختمان DNA و عواملی نظیر طول و تعداد نوکلئوتیدها، میزان نمک محیط و درصد GC بستگی دارد (Capote et al., 2012). از آنجایی که رنگ SYBR Green نمی­تواند بین محصولات دورشته‌ای مختلف تفاوتی قائل باشد و نتایج غالبا" بیشتر از غلظت اصلی برآورد می­شود (Capote et al., 2012; Primrose et al., 2001)، می‌توان با استفاده از منحنی ذوب تنوع محصولات (قطعات اختصاص/غیر اختصاصی و پرایمر-دایمر) را در فرآیند PCR مشخص کرد. بعد از اینکه PCR به اتمام رسید، دستگاه قادر به ترسیم نمودار ذوب هر نمونه بوده که این کار به­وسیله اندازه­گیری تغییرات فلورسانس در دماهای مختلف صورت می­گیرد. مراحل انجام کار به این ترتیب است که برای رسم منحنی، دستگاه دمای نمونه­ها را در فواصل زمانی مشخص (مثلاً هر10 ثانیه (به مقدار معینی تغییر می­دهد. بطور نمونه ابتدا دستگاه دمای نمونه­ها را به 94 درجه سانتیگراد رسانده که در این حالت تمام DNAها به صورت تک رشته­ای در آمده و میزان SYBR Green  متصل شده حداقل بوده و در نتیجه میزان فلورسانس ساطع شده کم می­باشد. به تدریج دستگاه دمای نمونه ها را در هر مرحله 5/0 درجه سانتی­گراد کاهش داده و به مدت 10 ثانیه در آن دما ثابت نگه داشته و در این مدت نور ساطع شده از نمونه­ها توسط دستگاه اندازه‌گیری می­شود. همزمان با این عمل منحنی تغییرات فلورسانس برحسب دما که همان منحنی ذوب است ترسیم می­شود (Ririe et al., 1997). توانایی پیش­بینی شکل و موقعیت منحنی ذوب برای طراحی و بهینه­سازی آزمون ضروری است. پیک­های اضافی در منحنی ذوب همیشه نشان­دهنده مشکل خاصی نیست. اگرچه اغلب فرض می­شود که یک تناظر یک طرفه بین تعداد قله ها و تعداد محصولات وجود دارد اما این امر به وضوح برای بسیاری از توالی­هایی که در آن­ها اختلاف توزیع گوانیدین- سیتوزین (GC) باعث تولید دامنه­های مختلف ذوب می شود، صادق نیست (et al., 2011 Dwight). به طور مثال در شکل1 منحنی ذوب برای دو قطعه تکثیر ­شده نشان داده شده است. پیک مجزا برای یک قطعه از اگزون b17 از ژن CFTR (شکل 1A.) معمولاً به عنوان خلوص آن قطعه تفسیر می­شود.


 

 

 

شکل 1- منحنی ذوب qPCR از (A اگزون b17 ژن CFTR و(B  اگزون 7 ژن CFTR.

Figure 1- The qPCR melting curve from A) Exon 17b of the CFTR gene and B) Exon 7 of the CFTR gene.

 

شکل 2- الکتروفورز ژل آگارز محصولات qPCR رنگ آمیزی شده با اتیدیوم بروماید از (A اگزون b17 ژن CFTR و(B  اگزون 7 ژن CFTR.

Figure 2- Agarose gel electrophoresis of qPCR products stained with ethidium bromide A) Exon 17b and B) Exon 7 of CFTR gene.


 

 

در مقابل، منحنی ذوب برای قطعه تکثیر ­شده از اگزون 7 ژن CFTR (شکل 1B.) دو پیک را نشان می­دهد که معمولاً به عنوان نشانه 2 قطعه تکثیر ­شده جداگانه تفسیر می­شود. اما، در واقع نتایج ژل الکتروفورز (شکل 2) نشان می­دهد که هر دو منحنی یک قطعه واحد را تولید کرده و یک محصول PCR واحد را تأیید نموده است (2014 Downey et al.,). نرم­افزار  uMelt SMبراساس مدل­های ذوب DNA با استفاده از ترمودینامیک نزدیکترین همسایه و محاسبات بازگشتی به وسیله مکانیک آماری طراحی شده است (Zimm, 1960; Crothers, 1968; Poland, 1974; Gotoh, 1983; Steger, 1994; Blake et al., 1999; Tøstesen et al., 2003; Markham & Zuker, 2005) که می­تواند آنالیز فلورسانس ذوب محصولات PCR را در یک برنامه سریع تحت وب پیش­بینی نماید. این نرم­افزار پیش­بینی منحنی ذوب را بطور دقیق و با وضوح بالا ارائه می­دهد. بارگذاری محصول PCR بر روی ژل آگارز، استانداردی برای بررسی محصولات PCR است. ضمناً هنگامی که یک تضاد ظاهری بین ژل و داده ذوب وجود دارد، uMelt SM می­تواند برای آزمایشات اعتبارسنجی فراهم کند. برای مثال، اختلاف مشاهده شده بین منحنی ذوب پیش­بینی شده با  منحنی ذوب دستگاه Real-Time PCR (شکل 3) بیانگر عدم صحت توالی­های تکثیر شده نمی­باشد. همچنین تصویر ژل (شکل 3) محصولات PCR با اندازه یکسان را تأیید می­نماید. با این حال، به علت توزیع متنوع GC در توالی ژن مورد نظر، چندین دامنه ذوب وجود خواهد داشت و دامنه ذوب متفاوت بیانگر تضاد محصولات تک باندی PCR (شکل 3) نمی­باشد. برای مثال ذکر شده، با توجه به اینکه دامنه‌های ذوب آزمایش از طریق پیش بینی uMelt SM بدست آمده بود لذا تأیید ژل آگارز غیر ضروری تلقی می­گردد (University of Utah).

مواد و روش­ها

نرم­افزار  uMelt SMبه صورت آنلاین به آدرس https://www.dna.utah.edu/umelt/umelt.html قابل دسترسی است. با کلیک کردن روی لینک نشان داده شده با پیکان در شکل 4، uMelt SM  راه اندازی می­شود. مراحل کار با نرم افزار، به ترتیب با شماره­گذاری در شکل5 نشان داده شده است.

ابزار­های کاربری ساده برای استفاده از این نرم­افزار شامل یک جایگاه اختصاصی برای وارد نمودن توالی قطعه تکثیر شده (شکل 5- شماره 1)، یک منوی کشویی برای انتخاب مدل پیش­بینی منحنی ذوب (شکل 5- شماره 2) و جایگاه­هایی در قسمت Standard برای وارد نمودن غلظت Na+، +Mg2 و DMSO (شکل 5- شماره 3) می­باشد.

مدل­های پیش­بینی منحنی ذوب، قبلا توسط مقالات مجلات براساس پارامترهای ترمودینامیک نزدیکترین همسایه از جمله روش­های مختلف تجزیه و تحلیل داده­ها، غلظت نمک­های مختلف و ... ارائه شده است که کاربر می­تواند با توجه به شرایط آزمایش و ژن مورد نظر، مدل مناسب را انتخاب نماید. برای تعریف شرایط آزمایشگاهی و مطابقت بهتر پیش­بینی منحنی ذوب مشاهده شده با نتایج منحنی ذوب حاصل از دستگاه، پارامترهای زیر در قسمت Advanced در شکل 5- شماره 3 ارائه شده و قابل تنظیم می­باشند (شکل 6).

 

 


شکل 3- الکتروفورز ژل آگارز و منحنی ذوب پیش­بینی شده و آزمایش مربوط به محصولات qPCR از اگزون 1-7 ژن CF.

Figure 3- Agarose gel electrophoresis and predicted melting curve and the assay for qPCR products from CF Exon 7-1.

 

 

 

 

 

 

شکل 4- لینک نرم­افزار uMelt SM.

Figure 4- uMelt SM software link.

 

 

 

 

 

 

 

 

شکل 5- مراحل کار با نرم­افزار uMelt SM.

Figure 5- Operational steps involved with the uMelt SM software.

 

 

  • α که شاخص بسته شدن حلقه[1] است.
  • σ به عنوان تعاون ذوب[2] تعریف می شود که در مولکول­های زنجیره ای بزرگ ساخته شده از بسیاری از واحدهای مشابه (یا تقریبا یکسان) (مانند DNA، پروتئین­ها و فسفولیپید­ها) مشاهده می­شود. زمانی که چنین مولکول­هایی تحت فرآیند انتقال فاز مانند ذوب شدن، بازشدن فولدینگ یا بازشدن بعد از پیچیده شدن، قرار می‌گیرند به­عنوان زیر مجموعه Cooperativity شناخته می­شوند. σ بالاتر (نزدیک به 1) موجب فرایند ذوب تدریجی­تر می­شود. پیشرفت­های اخیر در درک رفتار ذوب DNA دو رشته­ای همراه با روش­های مکانیک آماری منجر به برآوردهای بهبود یافته از فاکتورهای مربوط به آنتروپی حلقه1 برای رویدادهای جداسازی زنجیره­ها، به ویژه برای ذوب حلقه داخلی است.

 

 

 

شکل6- بخش تنظیمات α و σ.

Figure 6 – Setting section for α and σ.

 

 

در پژوهشی (2003) Blossey and Carlon جزئیات بیشتر استفاده از α و σ در تجزیه و تحلیل منحنی ذوب DNA برای توالی­ها در طیف گسترده­ای از طول (تقریباً بین 10-106 جفت باز) را ارائه داده­اند. در این مقاله جهت تأیید روش پیشنهادی، توالی دو ژن از قارچ Pyricularia oryzae  با مشخصات جدول 1 انتخاب و با استفاده از روش ارائه شده در کتاب راهنمای کاربردی NCBI استخراج گردید2013)  (Mahdizadeh et al.,. سپس پرایمرهای اختصاصی مربوط به آنها طراحی و توسط دستگاه Real-time PCR تکثیر و منحنی ذوب آن‌ها رسم شد. انالیز توالی­های به دست آمده در  uMelt  انجام و به­عنوان نمونه هایی از مقایسه منحنی ذوب آزمایش و منحنی پیش­بینی شده در این نرم­افزار مورد بررسی قرار گرفتند.


نتایج و بحث

در نرم­افزار uMeltSM  از دو متغیر α (شاخص بسته شدن حلقه) و σ (تعاون ذوب) برای محاسبه پارامتر آنتروپی حلقه (LEP)1 با فرمول 1 استفاده می­شود که برای تنظیم پارامترهای پایداری جفت باز به کار می­رود.

LEP(x) = σ × (N+1) – α                         (1)

در این فرمول، N طول توالی و x شاخص جفت باز است. فاکتورهای پایداری جفت باز2 بر اساس مقادیر ترمودینامیکی (آنتروپی، آنتالپی) برای نزدیک­ترین همسایه هر جفت در توالی محاسبه می­شود.

 



جدول 1- مشخصات دو ژن تکثیر شده در قارچ عامل بلاست برنج با Real-time PCR.

Table 1- Specifications of rice blast amplified genes using Real-time PCR.

 

GC

content

محتوای (گوانیدین- سیتوزین) %

 

 

PCR product size (bp)

اندازه محصول PCR

 

Sequence

توالی

 

Gene Name

نام ژن

 

 

 

50

 

 

 

164

AGGCCCATGTCTTCGAAATTTTTTGGCCATGATG

TTGGTGTGTTGGGGGGAGGCATGTCTAAAACTG

CAGGAAAAGTACGATGGTATTTGTCTTTAAGTA

GTTCGGCGTTGTCGCGCGGAGAAACCGGGCAGG

CGGACCACGTATTCGGGAGGTTGATGATACA

 

Actin

(اکتین)

 

 

47

 

 

 

176

 

CTATTAGATGTCCCAGCGATGCCGAGAACAGCA

TCTCTCCCGCCTTCTATTAGGGAATGGGCTTTAT

CGAGGCTGACGGGACACTTGCCGCCGGCATGGG

ATGTATAGACATAAAAACTGCTGTACCATGTTGT

ACATGTAACATACCTTTTAAATGGAGAAGAACA

GAACAAGGC

 

Superoxide dismutase

(سوپراکسید دیسموتاز)

 


الگوهای متفاوتی از تنظیمات ترمودینامیک نزدیکترین همسایه برای محاسبه فاکتور پایداری قابل انتخاب است (Dwight, University of Utah). برای محاسبه فاکتور پایداری جفت باز (S) از معادلات پایداری (1998) Blake and Delcourt با یک نسخه تغییریافته از معادله استفاده شده است (فرمول 2). تغییرات شامل کاتیون­های تک ظرفیتی (et al., 1998 SantaLucia)، یون Mg2+ آزاد (von Ahsen et al., 2001) و تنظیمات ترمودینامیکی است (Dwight, University of Utah).

(2)                     

در این معادله پارامترهای ΔH آنتالپی و ΔS آنتروپی از یکی از چندین کتابخانه ترمودینامیکی برداشت شده است. T دمای مطلق و R ثابت بولتزمن است. پارامترهای آنتروپی برای غلظت­های کاتیون تک ظرفیتی و Mg2+ تغییر می­یابد (Dwight et al., 2011). سپس روابط بازگشتی مورد استفاده قرار می­گیرد تا تمام پیکربندی های ممکن از مارپیچ3 به حالت­های ساختارهای تصادفی4 و احتمالات آن­ها حساب شود. مجموع این احتمالات، میزان مارپیچی بودن (فلورسانس) توالی بوده که در دمای مشخص شده به دست آمده است. در نهایت میزان مارپیچی بودن در برابر دمای مربوطه پیش­بینی شده است (Dwight, University of Utah).

منحنی­های ذوب (شکل 7- A) در حالت پیش­بینی مارپیچی بودن1 در مقابل دما نمایش داده می شود و پلات­های حاصله با استفاده از مشتق منفی مارپیچی بودن نسبت به درجه حرارت محاسبه می­شود (شکل 7-B). غلظت نمک، حضور مواد متصل به  DNA(مانند اتیدیدوم بروماید)، یونهای تک ظرفیتی، منیزیم آزاد، DMSO2، FBS3 و پارامترهای دیگر مانند pH، منحنی ذوب را تحت تاثیر قرار می­دهند. الگوریتم uMelt SMاجازه می­دهد تا برخی از این پارامترها به منظور بهتر منعکس کردن محتویات مسترمیکس‌های تجاری مختلف بهینه­سازی گردد (Facultad de Medicina UASLP, 2017).

علاوه بر منحنی ذوب، نمودار مشتق شده و پروفیل استاتیک ذوب، دینامیکی از پروفیل ذوب ارائه شده است که تجسم تفکیک رشته با تغییر دما می­باشد (شکل 8).

همانطور که از نتایج منحنی ذوب دو ژن اکتین و سوپراکسید دیسموتاز از قارچ Pyricularia oryzae در مقایسه با منحنی پیش­بینی شده مشخص است  uMelt SMبا پیش بینی منحنی ذوب محصولات PCR ، یک ابزار مناسب برای طراحی و بهینه­سازی آزمایشات ذوب با وضوح بالا را فراهم می­کند (شکل 9). نتایج ژل آگارز هم اختصاصی بودن قطعات تکثیر شده را تأیید می­نماید (شکل 10). اما با این تطابق لزوماً نیازی به ژل نیست و این نرم­افزار می­تواند سبب صرفه­جویی در زمان، مواد و تلاش در بخش تجربی گردد.

این آزمایش با دستگاه شرکتApplied biosystem مدل StepOne و با کیتSYBR Green انجام شد و دمای ذوب آزمایش برای ژن اکتین و سوپراکسید دیسموتاز به ترتیب °C 92/79 و  °C 82/80 بوده که میزان تخمینی آن با uMelt SM، °C 80 و °C 75/80 بدست آمد.

دمای ذوب تخمینی ممکن است تا حدودی با منحنی ذوب دستگاه ABI7500 متفاوت باشد، این تغییرات با EvaGreen بین 1/0 تا 3/0 و با SYBR Green بین 2/0 تا 4/1 درجه سانتی­گراد مشخص شده است (Facultad de Medicina UASLP, 2017). وجود اختلاف بین دمای ذوب حاصل از دستگاه و دمای ذوب تخمینی با نرم افزار، در محدوده مقادیر عنوان شده قابل قبول می­باشد.


 

 

 

 

شکل7-  A) منحنی ذوب: دما و فلورسانس. B) مشتق: دما و](دما)d/(مارپیچی بودن) [-d. C) پروفیل ذوب: شاخص توالی و Tm.

Figure 7- A) Melting curve: temperature and fluorescence. B) Derivative: Temperature and

-d(Helicity)/d(Temperature). C) Melting Profile: Sequence Index and Tm.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

شکل8- پروفیل دینامیکی ذوب.

Figure 8- Dynamic melting profile.

 

 

 

 

شکل 9- تطابق منحنی ذوب پیش بینی شده توسط uMelt SMو منحنی ذوب آزمایش برای ژن­های اکتین و سوپراکسید دیسموتاز در قارچ Pyricularia oryzae.

Figure 9- Matching the uMelt SM predicting melting curve and the experiment melting curve for actin and superoxide dismutase genes in Pyricularia oryzae fungus.

 

شکل10- نمونه محصولات qPCR روی ژل آگارز 1 درصد برای ژن­های اکتین و سوپراکسید دیسموتاز با نشانگر اندازه مولکولی bp100.

Figure 10- Samples of qPCR products on a 1% agarose gel for the Actin and SOD genes as compared with the 100 bp Ladder.

 

منابع

Blake RD, Delcourt SG (1998). Thermal stability of DNA. Nucleic Acids Research 26: 3323–3332.

Blake RD, Bizzaro JW, Blake JD, Day GR, Delcourt SG, Knowles J, Marx KA, SantaLucia J (1999). Statistical mechanical simulation of polymeric DNA melting with MELTSIM.  Bioinformatics (Oxford, England) 15: 370–375.

Blossey R, Carlon E (2003). Reparametrizing the loop entropy weights: effect on DNA melting curves. Physical Review E 68: 061911.

Capote N, Pastrana AM, Aguado A, Sánchez-Torres P (2012). Molecular tools for detection of plant pathogenic fungi and fungicide resistance. Plant Pathology, InTech, pp. 151-202.

Crothers DM (1968). Calculation of melting curves for DNA. Biopolymers 6: 1391–1404.

Downey N (2014). Interpreting melt curves: An indicator, not a diagnosis. DECODED Newsletter, from http://www.idtdna.com/pages/decoded/decoded-articles/core-concepts/decoded/2014/01/20/interpreting-melt-curves-an-indicator-not-a-diagnosis.

Dwight Z, uMelt Technical Guide v2.0, University of Utah, Wittwer DNA Lab, from http://www.dna.utah.edu/

Dwight Z, Palais R, Wittwer CT (2011). uMELT: prediction of high-resolution melting curves and dynamic melting profiles of PCR products in a rich web application. Bioinformatics 27: 1019–1020.

Gotoh O (1983). Prediction of melting profiles and local helix stability for sequenced DNA. Advance Biophysics 16: 1–52.

Markham NR, Zuker M (2005). DINAMelt web server for nucleic acid melting prediction. Nucleic Acids Research 33: W577–W581.

Mehdizadeh, V., Nassaghusseini, S M., Safaei, N., Saidi, A., NCBI: A Comprehensive Guide.  Agricultural Education and Extension Publication. 186 pages.  Tehran, Iran.2013.

Primrose SB, Twyman RM (2001). Old RW Principles of Gene Manipulation, Blackwell Publishing Company.

Ririe KM, Rasmussen RP, Wittwer, CT (1997). Product differentiation by analysis of DNA melting curves during the polymerase chain reaction. Analytical Biochemistry 245: 154-160.

SantaLucia J (1998). A unified view of polymer, dumbbell, and oligonucleotide DNA nearest neighbor thermodynamics. Proceedings of the National Academy of Sciences 95: 1460-1465.

Steger G (1994). Thermal denaturation of double-stranded nucleic acids: prediction of temperatures critical for gradient gel electrophoresis and polymerase chain reaction. Nucleic Acids Research 22: 2760–2768.

Tøstesen E, Liu F, Jenssen TK, Hovig, E (2003). Speed-up of DNA melting algorithm with complete nearest neighbor properties. Biopolymers 70: 364–376.

University of Utah, Department of pathology, Why Use uMELT?, from https://www.dna.utah.edu/umelt/um_gel.html

von Ahsen N, Wittwer CT, Schutz E (2001). Oligonucleotide melting temperatures under PCR conditions: nearest-neighbor corrections for Mg(2+), deoxynucleotide triphosphate, and dimethyl sulfoxide concentrations with comparison to alternative empirical formulas. Clinical Chemistry 47: 1956-61

Zimm BH (1960). Theory of “Melting” of the helical form in double chains of the DNA type. The Journal of Chemical Physics 33: 1349–1356.

 


Application of uMelt SM algorithm in Real-time PCR melting curve analysis

 

Kharabi Masooleh A.1, Saidi A.2*

 

1MSc of Agricultural Biotechnology, Department of Plant Sciences and Biotechnology, Faculty of Life Sciences and Biotechnology, Shahid Beheshti University, G.C. Velenjak, Tehran, Iran.

2Professor, Department of Plant Sciences and Biotechnology, Faculty of Life Sciences and Biotechnology, Shahid Beheshti University, G.C. Velenjak, Tehran, Iran.

 

 

Abstract

One of the challenges in interpreting the results obtained in qPCR is to make sure the amplicons are specific and that the melting curve analysis is used to examine it.  Additional peaks in the melting curve is not always indicative of a problem, for this purpose, in this paper, a web-based tool called uMelt SM is suggested to researchers as a practical and simple way for the correct analysis of the melting curve which provides the possibility of predicting the DNA melting curve and denaturation profiles of the high-fluorescence resolution of PCR products. The results of this study showed that the melting curves were generated based on parameters were generated and an appropriate algorithm for working with this software was presented.  Finally, actin and superoxide dismutase genes from Pyricularia oryzae were presented as a suitable model for determining the predicted curve using this software and Real-Time PCR curve was also drawn.  Results of the uMelt SM predicted melting curves showed a high degree of compliance with the real-time PCR melting curves, which confirms the advantages of ease of use, saving time, cost, and effort in the experimentalist part when using uMelt SM software.

Keywods: qPCR, melting curve, experiment, predict, uMeltSM.

 

 

 



* نویسنده مسئول: عباس سعیدی                              تلفن: 02129903244                                  abbas.saidi@gmail.com:Email    

[1] Loop closure exponent

[2] Melting cooperativity

 

1 Loop entropy

1 Loop entropy parameter

2 Base pair stability factors

3 Helix

4 Random coil

1 Helicity

2Dimethyl sulfoxide

3Fetal Bovine Serum

* Corresponding Author: Saidi A.                           Tel: +982129903244                         Email: abbas.saidi@gmail.com

 
Blake RD, Delcourt SG (1998). Thermal stability of DNA. Nucleic Acids Research 26: 3323–3332.
Blake RD, Bizzaro JW, Blake JD, Day GR, Delcourt SG, Knowles J, Marx KA, SantaLucia J (1999). Statistical mechanical simulation of polymeric DNA melting with MELTSIM.  Bioinformatics (Oxford, England) 15: 370–375.
Blossey R, Carlon E (2003). Reparametrizing the loop entropy weights: effect on DNA melting curves. Physical Review E 68: 061911.
Capote N, Pastrana AM, Aguado A, Sánchez-Torres P (2012). Molecular tools for detection of plant pathogenic fungi and fungicide resistance. Plant Pathology, InTech, pp. 151-202.
Crothers DM (1968). Calculation of melting curves for DNA. Biopolymers 6: 1391–1404.
Downey N (2014). Interpreting melt curves: An indicator, not a diagnosis. DECODED Newsletter, from http://www.idtdna.com/pages/decoded/decoded-articles/core-concepts/decoded/2014/01/20/interpreting-melt-curves-an-indicator-not-a-diagnosis.
Dwight Z, uMelt Technical Guide v2.0, University of Utah, Wittwer DNA Lab, from http://www.dna.utah.edu/
Dwight Z, Palais R, Wittwer CT (2011). uMELT: prediction of high-resolution melting curves and dynamic melting profiles of PCR products in a rich web application. Bioinformatics 27: 1019–1020.
Gotoh O (1983). Prediction of melting profiles and local helix stability for sequenced DNA. Advance Biophysics 16: 1–52.
Markham NR, Zuker M (2005). DINAMelt web server for nucleic acid melting prediction. Nucleic Acids Research 33: W577–W581.
Mehdizadeh, V., Nassaghusseini, S M., Safaei, N., Saidi, A., NCBI: A Comprehensive Guide.  Agricultural Education and Extension Publication. 186 pages.  Tehran, Iran.2013.
Primrose SB, Twyman RM (2001). Old RW Principles of Gene Manipulation, Blackwell Publishing Company.
Ririe KM, Rasmussen RP, Wittwer, CT (1997). Product differentiation by analysis of DNA melting curves during the polymerase chain reaction. Analytical Biochemistry 245: 154-160.
SantaLucia J (1998). A unified view of polymer, dumbbell, and oligonucleotide DNA nearest neighbor thermodynamics. Proceedings of the National Academy of Sciences 95: 1460-1465.
Steger G (1994). Thermal denaturation of double-stranded nucleic acids: prediction of temperatures critical for gradient gel electrophoresis and polymerase chain reaction. Nucleic Acids Research 22: 2760–2768.
Tøstesen E, Liu F, Jenssen TK, Hovig, E (2003). Speed-up of DNA melting algorithm with complete nearest neighbor properties. Biopolymers 70: 364–376.
University of Utah, Department of pathology, Why Use uMELT?, from https://www.dna.utah.edu/umelt/um_gel.html
von Ahsen N, Wittwer CT, Schutz E (2001). Oligonucleotide melting temperatures under PCR conditions: nearest-neighbor corrections for Mg(2+), deoxynucleotide triphosphate, and dimethyl sulfoxide concentrations with comparison to alternative empirical formulas. Clinical Chemistry 47: 1956-61
Zimm BH (1960). Theory of “Melting” of the helical form in double chains of the DNA type. The Journal of Chemical Physics 33: 1349–1356.