تنوع نوکلئوتیدی ژن­های مقاومت به زنگ قهوه­ای در ژنوتیپ­های مقاوم و حساس گندم نان

رحیمه همتی گوگه¹، سید ابوالقاسم محمدی*^2و3، سعید اهری­زاد²

¹ فارغ­التحصیل کارشناسی ارشد بیوتکنولوژی کشاورزی، گروه به­نژادی و بیوتکنولوژی گیاهی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه تبریز، تبریز، ایران

² استاد، گروه به­نژادی و بیوتکنولوژی گیاهی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه تبریز، تبریز، ایران

³ قطب علمی اصلاح مولکولی غلات، دانشگاه تبریز، تبریز، ایران

تاریخ دریافت: 21/10/1396، تاریخ پذیرش: 12/03/1397

چکیده

زنگ قهوه­ای (Leaf rust) یکی از بیماری­های مهم گندم در سطح جهان است که اپیدمی آن منجر به کاهش عملکرد و کیفیت گندم نان می­شود. در این مطالعه، تغییرات ساختاری و تنوع نوکلئوتیدی ژن­های مقاومت به زنگ قهوه­ایLr1، Lr21، Lr51 وLr39  در هفت ژنوتیپ گندم نان با واکنش متفاوت به زنگ قهوه­ای بررسی گردید. ژن­های مقاومت به زنگ قهوه­ای و یا نواحی پیوسته با این ژن­ها با استفاده از آغازگرهای اختصاصی طراحی شده بر اساس توالی­های موجود در بانک­های اطلاعاتی تکثیر شدند. قطعات تکثیری در باکتری E. coli همسانه­سازی و توالی­یابی گردیدند. هم­ردیف کردن توالی­ ژن­های مورد مطالعه با توالی­های موجود در بانک­ اطلاعاتی NCBI، شباهت بالای آن­ها را با توالی ژن­های مقاومت از جمله
ژن­های خانواده NBS-LR و RGAها نشان داد. هم­ردیفی قطعات تکثیر شده از ژن­های مورد مطالعه با توالی­های موجود در NCBI نشان دهنده شباهت  قطعه تکثیر شده از ژن­ Lr51، با ژن agp2  بود. توالی ژن­­ Lr39 با ژن VRN1، مسئول بهاره­سازی در گندم زمستانه، 88 شباهت درصد داشت. نتایج بدست آمده از هم­ردیف کردن توالی­ها و گروه­بندی آن­ها، حاکی از وجود تغییرات ساختاری و تنوع نوکلئوتیدی این ژن­ها در ارقام مورد مطالعه بود. نسبت جایگزینی­های همنام به ناهمنام Ka/Ks)) در قطعات تکثیر شده از ژن Lr1 با استفاده از جفت آغازگرهای Lr1-2، Lr1-3 وLr1-4  و ژن­های Lr21 وLr39  کوچکتر از یک و نشان دهنده گزینش منفی برای جایگزینی یک اسیدآمینه در این ناحیه از این ژن­ها بود. در قطعه ژن تکثیر شده از ژن Lr1 با استفاده از جفت آغازگر Lr1-5 نسبت Ka/Ks بیشتر از یک و نشان دهنده گزینش مثبت یا گزینش در جهت ایجاد تنوع برای جایگزینی یک اسیدآمینه است. از نظر توالی­ ژن­های Lr1، Lr21، Lr39 وLr51، ژنوتیپ­های مورد مطالعه فقط از نظر چند نوکلئوتید تفاوت داشتند که براساس این تفاوت­های نوکلئوتیدی می­توان آغازگرهای اختصاصی مبتنی بر SNPها جهت شناسایی ژنوتیپ­های حساس و مقاوم طراحی کرد.

کلمات کلیدی: زنگ قهوه­ای، تنوع نوکلئوتیدی، ژن­های مقاومت به بیماری.

مقدمه

در بین گیاهان زراعی، گندم نان بزرگتــــرین ژنــوم را دارا است (Arumuganathan & Earle, 1991) که حدود 90–80 درصد آن دارای توالی­های تکراری بوده و 70 درصد عناصر متحرک [1] (TEs) می­باشد (Feuillet et al., 2003; Li et al., 2004). زنگ قهوه­ای یکی از بیماری­های قارچی مهم گندم است که بیشترین پراکنش را در سطح جهان دارد و تولید گندم را تحت تاثیر قرار می­دهد. در نقاطی که ارقام حساس کشت شده باشند و شرایط محیطی برای ایجاد آلودگی بوسیله یوردینیا مناسب باشد، به میزان زیادی روی پهنک برگ­ها مشاهده می­شود. اپیدمی این بیماری خسارت شدیدی به عملکرد دانه وارد کرده و کیفیت غذایی آن­ را پائین می­آورد (Ling et al., 2004).

گیاهان دارای مکانیسم­های دفاعی موثری برای شناسایی و پاسخ به آلودگی­های ایجاد شده توسط پاتوژن­ها می­باشند. آنالوگ­های ژن­های مقاومت گیاهی ([2]RGAs) بعنوان ژن­های کاندیدا، دارای موتیف­ها و دومین­های حفاظت­شده­ای هستند که نقش خاصی را در مقاومت به پاتوژن ایفا می­نمایند (Sekhwal et al., 2015). شناخته شده­ترین RGAها دارای ناحیه اتصال به نوکلئوتید، ناحیه غنی از لوسین، شبه گیرنده­های کینازی[3]RLK، و شبه گیرنده­های پروتئینی RLP[4] می­باشند. با استفاده از ویژگی­های فوق تاکنون پنج گروه از ژن­های مقاومت شناسائی شده­اند. بزرگترین گروه این ژن­ها پروتئین­هایی را با جایگاه [5]NBS–LRR رمز می­کنند (Huang et al., 2003). این پروتئین­ها یک جایگاه مرکزی با یک مکان اتصال به نوکلئوتید دارند (Hommand–Kosak & Jones, 1997). مرکز این جایگاه می­تواند دارای یک جایگاه P–loop/Kinase1–a، جایگاه کیناز2، کیناز3 و یک جایگاه آبگریز باشد. با استفاده از آغازگرهای طراحی شده بر اساس (GLPL) P–loop/Kinase  همولوگ های زیادی از NBS را در گونه­های مختلف گیاهی شناسایی شده است (Mayerse et al., 1999). این پروتئین­ها دارای یک جایگاه حفاظت شده دیگر در انتهای آمینی با بنیان­های تکراری غنی از لوسین می­باشند. جایگاه LRR در برخی از محصولات ژن­های R بعنوان جایگاه اتصال برای لیگاند[6] محسوب می­شود، این لیگاند در نتیجه فعالیت ژن Avr ایجاد می­گردد (Bent, 1996).

بیش از 50 ژن مقاومت به زنگ قهوه­ای در ژرم پلاسم­های گندم و گونه­های خویشاوند وحشی آن شناسایی و تعدادی از آن­ها در
برنامه­های اصلاحی گندم استفاده شده است (Feuillet et al., 2003). جایگاه کروموزومی اغلب ژن­های مقاومت به زنگ قهوه­ای تعیین و تحت نام­های Lr1 تا Lr51 شماره­گذاری شده­اند (Kolmer, 1996). سه ژن Lr1،  Lr10 و Lr21 از گندم هگزاپلوئید جداسازی و همسانه سازی شده­اند (Cloutier et al., 2007; Feuillet et al., 2003; Huang et al., 2003). ژن Lr1 اولین­ بار از رقمMalacof  گزارش (Mains et al., 1923; Ausemus et al., 1946) و سپس در گندم هگزاپلوئید Glenlea نیز شناسایی گردید (Sambroski, 1973 ; Dyck et al., 1985; McVey, 1989). Lr1 یک ژن مقاومت به بیماری با جایگاه Coiled Coil، NBS و LRR می­باشد (Cloutier et al., 2007).

ژن Lr21 از ­گونه Aegilops tauschii به رقم Thacher گندم نان منتقل شده است (Rowland & Kerber, 1974). این ژن اولین بار توسط Huang et al.  (2003) جداسازی و همسانه شد. ژن Lr21 در ناحیه غنی از ژن در قسمت انتهایی بازوی کوتاه کروموزوم 1D گندم نان به طول 4359 جفت باز قرار دارد و  ناحیه رمزکننده ژن Lr21، پروتئینی با یک جایگاه  NBS حفاظت شده و 13 تکرار غنی از لوسین ناقص متعلق به خانواده  NBS–LRRرا رمز می کند (Huang et al., 2003).

ژن Lr51 از کروموزوم 1S Triticum speltoides از طریق جابجائی یک قطعه کروموزومی به بازوی بلند کروموزوم 1B گندم نان منتقل شده است (Helguera et al., 2005). ژن Lr39 روی بازوی کوتاه کروموزوم 2D قرار دارد و مقاومت به زنگ قهوه­ای را در مرحله گیاهچه و گیاه بالغ القاء می­کند. بررسی­ها نشان داده است که این ژن از سایر ژن­های Lr متفاوت می­باشد. از هشت نشانگر ریزماهواره برای تجزیه پیوستگی این ژن در کروموزوم 2D استفاده شده است.  منشاء این ژن گونه Ae. tauschii بوده و از طریق تلاقی بین­گونه­ای به گندم نان منتقل شده است (Raupp et al., 2001).

هدف از این بررسی، جداسازی قطعاتی از ژن­ها یا نواحی پیوسته با آن­ها، همسانه ­کردن و توالی­یابی ژن­های مقاومت به زنگ قهوه­ای Lr1، Lr21، Lr51 و Lr39 در هفت ژنوتیپ گندم نان با واکنش متفاوت به زنگ قهوه­ای جهت یافتن تنوع نوکلئوتیدی موجود در این نواحی بود.

مواد و روش­ها

مواد گیاهی شامل هفت ژنوتیپ گندم نان با درجات متفاوت مقاومت به زنگ قهوه­ای در مرحله گیاهچه و گیاه کامل بودند که از موسسه تحقیقات اصلاح و تهیه نهال و بذر کشور تهیه شدند (جدول 1).

جدول 1- واکنش ژنوتیپ­های گندم نان مورد مطالعه به زنگ قهوه­ای در مرحله گیاهچه و گیاه کامل.

Table 1- Response of the he studied bread wheat genotypes to leaf rust at seedling and adult plant stages.

استخراج DNAژنومی با روش CTAB  (Saghai-Maroof et al., 1984) انجام و کمیت و کیفیت نمونه­های DNA­ با استفاده از اسپکتروفتومتر و الکتروفورز ژل آگارز 8/0 درصد تعیین شد. برای تکثیر ژن­های مقاومت به زنگ قهوه­ای Lr1، Lr21، Lr51 و Lr39 از جفت آغازگرهای طراحی شده بر اساس اطلاعات موجود در NCBI استفاده شد (جدول 2).

جدول 2- آغازگرهای مورد استفاده برای تکثیر ژن­های مقاومت به زنگ قهوه­ای Lr1، Lr21، Lr51 و Lr39 و دمای اتصال آن­ها.

Table 2- The primer used for amplification of leaf rust resistance genes Lr1, Lr21, Lr51, and Lr39 and their annealing temperatures.

واکنش زنجیره­ای پلی­مراز در حجم نهایی
 µl10 و با استفاده از پروتکل سیمیت (CIMMYT, 2005) انجام شد. قطعات تکثیری پس از جداسازی از ژل به ناقل pTZ57RT الحاق و در باکتری E. coli سویهDH5α  همسانه شدند. تهیه­ سلول­های مستعد با استفاده از روش کوهن و همکاران (Cohen et al., 1972) انجام و کلنی­های سفید رنگ حاوی قطعات تکثیری برای استخراج پلاسمید انتخاب گردیدند. استخراج پلاسمید براساس روش پیشنهادی بیرنبوئیم و دالی (Birnboim & Doly, 1979) صورت گرفت و قطعات برای توالی­یابی به شرکت ماکروژن [7] کره­جنوبی ارسال شد. توالی­های حاصله با استفاده از برنامه­ Chromas Lit 2.01 تجزیه و تحلیل شد. مقایسه توالی­ها با همولوگ­های آن با استفاده از الگوریتم هم­ردیفی چندگانه در Clastalx ver. 1.8 وClastalw ver 1.6  انجام و دندروگرام با استفاده از لگوریتم Neighbor Joining   (Saitou  & Nei, 1987) و ضریب فاصله P-distance در برنامه MEGA 4 ترسیم گردید (Kulmar et al., 2008). تنوع نوکلئوتیدی بین ارقام و میزان جایگزینی­های همنام (Ks) و جایگزینی­های غیرهمنام (Ka) در ژن­های مورد بررسی با استفاده از برنامه DNAsp ver 4.0 برآورد شد (Rozas et al., 2010). میزان شباهت ها و تفاوت­ها با توالی های موجود در بانک­های اطلاعاتی از جمله [8]NCBI از طریق بلاست این توالی­ها بدست آمد.

نتایج و بحث

با استفاده از جفت آغازگر D14، قطعاتی به طول 1500 جفت باز از ژن Lr21 تکثیر شد. شکلa1  نشانگر ناحیه تکثیر شده از این ژن با استفاده از آغازگر و شکل a2 نشان دهنده قطعات پس از همسانه سازی و برش آنزیمی می­باشد. تنوع نوکلئوتیدی برابر با 4/0 بود. جستجو در بانک­های اطلاعاتی NCBI و UniProt برای دومین­های حفاظت شده نشان داد که این ژن متعلق به خانواده NB-ARC superfamily با 192 آمینواسید است (شکل 1). طول کامل ناحیه رمز کننده این ژن برابر با 3243 جفت باز با توالی موجود در NCBI  با شماره دسترسی FJ876280  در گندم نان مشابهت داشت. هم­ردیف کردن توالی­ این ژن در ژنوتیپ­های مورد مطالعه با توالی­های موجود درNCBI نشان دهنده شباهت 99 درصدی آن­ها با توالی­های ژن­ Lr21 درNCBI و الل نوترکیب S مربوط به ژن Lr21 ازAe. tauschii   بود. همچنین توالی ژن Lr21 در ژنوتیپ­های مورد مطالعه با  RGAها از گروه LZ–NBS–LRR، پروتئین­های دفاعی شبه [9]HCBT و LZ–NBS–LRR  از Ae. tauschii نمونه TA2468، شباهت90 درصدی نشان دادند. اطلاعات مربوط به ژن­ها و درصد شباهت آن­ها در جدول 3 آورده شده است. هانگ و همکاران (Huang et al., 2003) نیز با استفاده از نشانگر اختصاصی STS،KSUD14-STS  قطعه 1410 جفت­بازی را در گندم­های تراریزش شده بوسیله کلون کاسمید 1-7-69 تکثیر کردند. علاوه بر این، در برخی از ارقام مقاوم به پاتوژن، یک قطعه 1360 جفت بازی از این ژن تکثیر شد. بر اساس توالی­یابی مجدد مبتنی بر جمعیت، چهار حذف/اضافه (indel) (2 جفت باز در ناحیه اسید آمینه­ای، 88 یا 105 جفت باز در اولین اینترون، یک جفت باز در ناحیه NBS و یک حذف و اضافه در ناحیه LRR) و 13 چندشکلی تک نوکلئوتیدی SNP در ارقام گندم  معرفی شده در زمان های مختلفی در ژن Lr21 شناسایی شد (Fu et al., 2010). در پژوهشی Neelam et al. (2013) نیز آغازگرهای اختصاصی آلل برای ارزیابی­های KASPar در محدوده ناحیه اتصال حذف/اضافه در موقعیت 1346 جفت بازی طراحی کردند. با استفاده از چهار جفت آغازگر Lr1-2، Lr1-3، Lr1-4 وLr1-5 بترتیب قطعاتی به طول 244، 226، 788 و 780 جفت باز از ژن Lr1 تکثیر شد (شکل b2). قطعات ژن Lr1 با توالی ژن Lr1 موجود در NCBI رقم Glenlea شباهت 100 درصد و با ژن Lr34 شباهت 88 درصد نشان داد که می­تواند نشان دهنده شباهت ساختاری این دو ژن باهم باشد. قطعه تکثیر شده با آغازگر Lr1-5 با پروتئین RLP: Receptor-like protein 12 از T. urartu با شماره دسترسی EMS65378.1 دارای شباهت 75 درصدی بود (شکل a4). این پروتئین با نام LRR-RI (تکرارهای غنی از لوسین- بازدارنده ریبونوکلئاز)، معمولا در غشای پلاسمایی واقع شده و در روابط متقابل پروتئین – پروتئین دخالت دارد. همچنین قطعه تکثیر شده با آغازگر Lr1-3 نیز متعلق به Lr1 و خانواده بزرگ دومین P-loop NTPase  در گندم نان با شماره دسترسی ABS29034.1 بود (شکل b4). این قطعه با پروتئین مقاومت به بیماری RGA3 از
Ae. tauschii subsp. tauschii با شماره دسترسی XP_020148468.1 نیز شباهت 100 درصدی داشت که این پروتئین هم دارای یک
NB-ARC domain می­باشد (شکل 3). در پژوهشی Qiu et al. (2007) براساس چهار RGA از ارقام مقاوم و حساس، آغازگرهای اختصاصی طراحی و قطعاتی را تکثیر، همسانه سازی و توالی­یابی کردند. آن­ها اختلافات موجود بین لاین­های مادری جمعیت هدف، جهت تعیین نقشه فیزیکی، را شناسایی نموده و بر پایه تفاوت های نوکلئوتیدی موجود توانستند آغازگرهای Lr1RGA1 و Lr1RGA2 را طراحی کنند. با استفاده از نشانگر CAPS به نام Lr1RGA1 قطعاتی بطول 760 جفت باز تکثیر شد.

شکل 1- ساختار سه بعدی Glucose-1-phosphate  adenylyltransferase large subunit 1 با 516 اسید آمینه (UniProtKB با شماره دسترسی P55241).

Figure 1-  Three dimensional structure of Glucose-1-phosphate  adenylyltransferase large subunit 1 with 516 amino acid residue (UniProtKB with Accession NO P55241).  

جدول 3- شباهت قطعه توالی یابی شده از ژن Lr21 با توالی­های موجود در NCBI.

Table 3- Similarity of sequenced fragments from Lr21 gene with the sequences available in NCBI.

با استفاده از جفت آغازگر S30–13L و AGA7–759R، قطعاتی از ژن Lr51 بطول 793 جفت باز در چهار رقم بولانی (792 جفت باز)، N-80-6 (مغان 3) (672)، پیشتاز (677) و بولوئیکا (بهار) (69 جفت باز) تکثیر و توالی­یابی شد (در سه ژنوتیپ MKH3، MKH4 و MV17 قطعه­ای تکثیر نشد). بلاست توالی­ها نشان داد که این ژن با ژن agp2 رمز کننده زیر واحد بزرگ ADP– گلوکز پیروفسفوریلاز، شباهت 98 درصدی و با پروتئین Glucose-1-phosphate  adenylyltransferase large subunit 1  شباهت 99 درصدی دارد. این پروتئین در کلروپلاست و آمیلوپلاست واقع شده و ساختار سه بعدی آن در شکل 5 آورده شده است.

شکل2- a1) قطعه 1442 جفت بازی از ژن Lr21، a2) الگوی نواری پلاسمیدهای برش­یافته با آنزیم­های EcoRI و HindIII. و قطعه درجی 1442جفت بازی، b) قطعه 300 جفت بازی از ژن Lr1.، c) قطعه 500 جفت بازی از ژن Lr39 و (d نشانگر100 جفت­بازی.

Figure 2- a1) 1442 bp fragment from Lr21 gene, a2) Banding pattern of plasmids digested with EcoRI and HindIII enzymes, b) inserted fragment with length of 244 bp from Lr1, c) 500bp fragment for Lr39 gene and d) 100bp ladder.

شکل3-  ساختار سه بعدی دومین حفاظت شده NB-ARC در ژن Lr21.

Figure 3- Three dimensional structure of conserved NB-ARC domain in Lr21 gene.

شباهت 90 درصدی این قطعه با قطعه ژن Lr51 از رقم Neepawa با شماره دسترسی AY589011.1 و شباهت 98 درصدی با توالی دیگر این ژن با شماره دسترسی AY589012.1  مشاهده شد. هلگوئرا و همکاران (Helguera et al., 2005) نیز قطعات 790 و 800
جفت­بازی از این ژن را تکثیر کردند.

با استفاده از آغازگر Gdm35 قطعاتی با طول­های­ 227، 247، 192، 224، 269، 197 و 190 جفت بازی به ترتیب در بولانی، بولوئیکا، MKH3، MKH4، پیشتاز، MV17 و N-80-6 تکثیر و توالی یابی شد (شکل 2c, 2d). راپ و همکاران (Raupp et al., 2001) با استفاده از آغازگرهای ریزماهواره GWM296 و GWM210 به ترتیب قطعاتی بطول 145 و 190 جفت باز در گندم­های مقاوم و نمونه TA1675
Ae. tauschii تکثیر کردند. هم­ردیفی
توالی­ ژن Lr39 با توالی­های موجود در پایگاه اطلاعاتی NCBI نشان­دهنده شباهت 77 درصدی آن با توالی ژن Lr1 از رقم Glenlea بود. توالی ژن Lr39 در ارقام مورد مطالعه با توالی ژن VRN1 با شماره دسترسی AY188331.1 که مسئول بهاره­سازی در گندم زمستانه است، نیز شباهت 88 درصدی داشت.

شکل 4-  (aساختار سه بعدی Receptor like protein در ژن Lr1، (b ساختار سه بعدی پروتئین متعلق به Lr1 از خانواده P-loop NTPase domain superfamily .

Figure 4- a) Three dimensional structure of Receptor like protein in Lr1 gene, b) Three dimensional structure of protein belonging to Lr1 gene from P-loop NTPase domain superfamily.

گروه­بندی ژنوتیپ­ها براساس توالی ژن­های مورد بررسی در شکل 5 آورده شده است. براساس توالی ژن­های Lr1 و Lr21، رقم مقاوم MV-17 و رقم حساس بولانی در گروه­های مجزا قرار گرفتند (شکل­های  5aو 5c) که این به دلیل تفاوت ساختاری این ژن­ها در ارقام مقاوم و حساس است. نتایج بدست آمده از هم­ردیف کردن توالی­ها و گروه بندی آن­ها، حاکی از وجود تغییرات ساختاری و تنوع نوکلئوتیدی در بین ارقام بود. در گروه بندی با Lr1-3 و Lr1-5 رقم MV-17 و پیشتاز در یک گروه، N-80-6، بولانی و بولوئیکا در نیز در یک گروه و MKH3 و MKH4 نیز در گروه جدا قرار گرفتند. می­توان گفت براساس گروه بندی با Lr1، Lr39 و Lr21 ارقام حساس و مقاوم جدا شده­اند. اما این گروه­بندی نتوانست ارقام نیمه حساس- حساس، نیمه مقاوم – حساس را جدا کند. برای ژن Lr51، قطعه­ای از رقم مقاوم MV-17 تکثیر نشد.

همردیفی قطعات تکثیر شده از ژن Lr39، Lr1-2 و Lr51 در شکل 6 و هم ردیفی قطعات تکثیر شده از ژن Lr21 در شکل 7 نشان داده شده است. ژن­های Lr21 وLr1 تکثیر شده توسط سه آغازگر فقط از نظر چند نوکلئوتید در بین ارقام تفاوت نشان دادند، ولی از نظر توالی ژن­های Lr51 وLr39 تفاوت بالایی مشاهده شد. این تفاوت بالا احتمالاً می­تواند بدلیل وجود توالی­های تکراری و ترانسپوزون­ها باشد. وجود تعداد زیاد توالی­های تکراری و بزرگ بودن ژنوم گندم نان از عواملی است که شناسایی  و همسانه­سازی ژن­ها را با مشکل مواجه می­سازد (Feuillet et al., 2003). محققان دیگر (Huang et al., 2003) نیز بعد از توالی­یابی مشاهده کردند که بعضی از این توالی­ها با اجزای شبه ترانسپوزونی یا با پروتئین­هایی که عملکرد آن­ها شناخته شده نیست، همردیف می­شوند. پروتئین­های گیاهی که بوسیله ژن­های مقاومت به بیماری رمز می­شوند، در شناسایی حمله پاتوژن­ها و سپس در فعال کردن مکانیسم­های دفاعی دخالت دارند. نوع
(CNL: Coiled coil Nucleotide binding site Leucine rich region) از ژن­های مقاومت به بیماری در همه گونه­های گیاهی وجود دارند.

مطالعه­ای توسط Benson et al. (2014) با هدف شناسایی عناصر تنظیم کننده با فعالیت Cis (CREs) در ژن­های مقاومت به بیماری CNL، تعیین تنوع وتوزیع آن­ها در بین 6 گونه گیاهی Oryza sativa ، Glycine max، Populus trichocarpa، Medicago truncatula، Phaseolus vulgaris  و Arabidopsis thaliana انجام شد. آن­ها به روش تجزیه in silico  نشان دادند که هشت CRE در همه ژن­ها مشترک بود و 30 مورد از CREها فراوانی بیشتر از 10 در هر ژن داشتند. O. sativa به عنوان تنها تک ­لپه­ای موجود در این گروه بطور قابل توجهی تعداد پائین­تری CRE نسبت به گونه­های دولپه­ای داشت. این مطالعه نشان داد که هشت CRE شناسایی شده در 2 کیلو باز ناحیه بالاتر از ژن در همه ژن­های CNLهای نمونه­برداری شده وجود داشتند. آن­ها نتیجه گرفتند که این CREها در شروع فرایندهای رونویسی دخالت دارند. بنابراین، شناسایی و بکارگیری آن­ها در تعیین ژن­های مقاومت پایدار که به روش­های قابل پیش­بینی رونویسی شوند و در فرایندهای انتخاب طبیعی در تولید گیاهان مقاوم اهمیت دارد و می­تواند در اصلاح گیاهان مقاوم به بیماری مفید واقع شود بود.

در جدول 4 میزان جایگزینی­های همنام (Ka) و ناهمنام Ks)) در ژن­های مورد مطالعه آورده شده است. نسبت Ka/Ks در قطعه ژن Lr1 تکثیر شده با جفت آغازگرهای Lr1-2، Lr1-3 وLr1-4  و در قطعات تکثیر شده از ژن­های Lr21 وLr39  کوچکتر از یک (Ka/Ks [10] برای جایگزینی یک اسیدآمینه در این ناحیه از ژن Lr1 و ژن­های فوق می­باشد. این حالت در جهت حذف جایگزینی­های نامطلوب اتفاق می­افتد. در قطعه ژن تکثیر شده از ژن Lr1 با جفت آغازگر Lr1-5 نسبت Ka/Ks بزرگتر از یک (Ka/Ks >1) بود که نشان  می­دهد گزینش مثبت یا گزینش در جهت ایجاد تنوع[11] برای جایگزینی یک اسیدآمینه اتفاق افتاده است. این حالت گاهی­ اوقات در پروتئین­های آنتی­ژنی رمزشده بوسیله پاتوژن­ها مشاهده می­شود که تحت فشار گزینشی شدید در جهت ایجاد تغییر به منظور اجتناب از واکنش­های ایمنی در میزبان است. این نوع گزینش برای تثبیت جایگزینی­های مطلوب استفاده می­شود. بالاترین نسبت جایگزینی­های همنام در قطعه ژن Lr1 تکثیر شده با جفت آغازگر Lr1-5  مشاهده شد که نشان دهنده گزینش مثبت در این ناحیه از ژن Lr1
می­باشد. در Lr51 این نسبت محاسبه نشد، که بدلیل عدم تکثیر در برخی از ژنوتیپ­ها بود.

در پژوهشی Jiang et al. (2007) با بررسی تنوع نوکلئوتیدی ناحیه LRR در ژن­های مقاومت گیاهان گزارش کردند که میزان تنوع نوکلئوتیدی و نسبت جایگزینی­های مشابه به جایگزینی­های غیر مشابه در واحدهای LRR بطور معنی­داری متفاوت است. آنها در کل ناحیه LRR یک نسبت معنی­داری از Ka>Ks در چهار ژن L، P، RPP13 و RPP8 را شناسایی کردند. این نسبت نشان می­دهد که ناحیه LRR در برخی از ژن­های مقاومت تحت فشار گزینشی در جهت ایجاد تنوع قرار گرفته است.

سپاسگزاری

از قطب علمی اصلاح مولکولی غلات دانشگاه تبریز که هزینه این پژوهش را تامین کرده است تشکر و قدردانی می شود.

شکل 5- گروه­بندی ارقام گندم مورد مطالعه براساس توالی ژن­های Lr1 (5a)، Lr39 (5b)، Lr21 (5c) و Lr51 (5d).

Figure 5- Grouping of wheat genotypes based on Lr1 (5a), Lr39 (5b), Lr21 (5c) and Lr51 (5d) genes sequence.

جدول 4-  نسبت جایگزینی­های مشابه و غیرمشابه در ژن­های مقاومت به زنگ قهوه­ای مورد بررسی.

Table 4- Synonymous and nonsynonymous substitution rates in the studied leaf rust resistance genes.

^a  میانگین تنوع نوکلئوتیدی در همه جفت مقایسات در ژن­های مورد بررسی.

^a The mean of nucleotide diversity in all Pairs of comparisons in the studied genes. 

^b میانگین نسبت Ka/Ks در همه جفت مقایسات در ژن­های مورد بررسی.

^b The mean of Ka/Ks rates in all Pairs of comparisons in the studied genes. 

شکل 6- هم ردیفی توالی­ 244، 396 و 158 جفت بازی بترتیب از ژن­های Lr1 ، Lr39 و Lr51 . از جفت آغازگر Lr1-2، Gdm35،S30–13L و  AGA7–برای تکثیر ژن­های مربوط در هفت ژنوتیپ استفاده شد. جایگاه­های چندشکل با رنگ متفاوتنشان داده شده­اند.

Figure 6- Sequence alignment of 244, 396, and 158 bp fragments from Lr1, Lr39 and Lr51 genes, respectively.  Primer pairs Lr1-2, Gdm 35, AGA7–759R and S30–13L were used to amplify the genes in seven genotypes. Polymorphism sites are shown with different colors.