بررسی فعالیت ضد باکتریایی و سمیت پپتید نوترکیب LasioglossinΙΙΙ بر پاتوژن های شاخص مواد غذایی

بررسی فعالیت ضد باکتریایی و سمیت پپتید نوترکیب LasioglossinΙΙΙ بر پاتوژن های شاخص مواد غذایی

محمد باقر حبیبی نجفی*¹، عباس تنهاییان²، پریا رهنما³، مرجان ازغندی⁴

¹استاد گروه علوم و صنایع غذایی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه فردوسی مشهد، مشهد، ایران.

²دانشجوی دکتری بیوتکنولوژی کشاورزی، گروه بیوتکنولوژی و به نژادی گیاهی، دانشگاه فردوسی مشهد، مشهد، ایران.

³دانشجوی دکتری میکروبیولوژی مواد غذایی، گروه علوم و صنایع غذایی، دانشگاه فردوسی مشهد، مشهد، ایران.

⁴دانشجوی دکتری علوم دامی، گروه علوم دامی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه فردوسی مشهد، مشهد، ایران.

تاریخ دریافت: 22/04/1397، تاریخ پذیرش: 24/08/1397

چکیده

افزایش مقاومت میکروارگانیسم­ها به آنتی بیوتیک­های رایج منجر به یافتن ترکیبات ضد میکروبی جدید شده است. پپتیدهای ضد میکروبی یکی از گزینه­های مناسب برای جایگزینی آنتی بیوتیک­های موجود می­باشند. لازیوگلوسین­ها گروهی از پپتیدهای زیست فعال می­باشند که در مطالعه حاضر، عملکرد ضد میکروبی پپتید نوترکیب لازیوگلوسین ɪɪɪ بر پنج عامل بیماری‌زای باکتریایی غذایی (باکتری های استافیلوکوکوس اورئوس، سالمونلا تیفی موریوم،  انتروکوکوس فکالیس، لیستریا مونوسیتوژنز و اشرشیا کلی) و همچنین بررسی دوز سمیت آن بر یک  رده سلول انسانی مورد ارزیابی قرار گرفت. نتایج حکایت از عملکرد ضد میکروبی مناسب پپتید نوترکیب دارد به صورتی­که حداقل غلظت بازدارندگی(MIC ) و کمترین غلظت کشندگی(MBC) پپتید لازیوگلوسین ɪɪɪ بر باکتری های مورد آزمون به ترتیب در محدوده µg/ml 625/8-851/3 و µg/ml 406/15-703/7 بود. نتایج حاکی از آن بود که باکتری استافیلوکوکوس اورئوس بیشترین حساسیت را به این پپتید دارد به طوری که مقادیر MIC و MBC آن به ترتیب 851/3 و 703/7 بود. غلظتی از پپتید که اثر سمی بر روی سلول­های کلیه جنین انسان نشان داد (1652 µg/ml)  به مراتب بیشتر از مقادیر MIC و MBC بدست آمده بود. نتایج این مطالعه نشان داد خاصیت باکتری­کشی این پپتید با آنتی بیوتیک­­های رایج قابل رقابت می­باشد.

کلمات کلیدی: پپتید لازیوگلوسین  ɪɪɪ، پپتید ضد میکروبی، سمیت سلولی، پاتوژن غذایی.

مقدمه

ایمنی مواد غذایی یک نگرانی رو به رشد در سراسر جهان است. بیماری­های ایجاد شده بوسیله مواد غذایی از مهمترین مشکلات سلامت عمومی به شمار می­روند و همه ساله موجب ابتلا و مرگ و میر تعداد قابل توجهی از مردم می­شوند. علل شایع بیماری های منتقله از غذا شامل باکتری­ها، سموم باکتریایی، ویروس ها و انگل­ها هستند. شایعترین این عوامل باکتری ها هستند، چراکه اقدامات نامناسب برای تهیه و جابه جایی غذا باعث آلودگی، بقا و رشد باکتری­های بیماری زا می­گردد (Chopra et al., 2015; Koek et al., 2006). صنعت غذا برای حفظ کیفیت و افزایش زمان ماندگاری مواد غذایی به طور گسترده از نگهدارنده های شیمیایی استفاده می کند. از طرفی مصرف غذاهای فرآوری شده با مواد نگهدارنده شیمیایی منجر به افزایش نگرانی مصرف کنندگان و تقاضا برای مصرف غذاهای طبیعی و با حداقل مواد نگهدارنده شیمیایی شده است. لذا نیاز مبرم به یافتن نگهدارنده های طبیعی برای مواد غذایی احساس می شود (Espitia et al., 2012). مشکل اصلی در صنایع غذایی آلودگی مواد غذایی با پاتوژن­هایی مثل سالمونلا، شیگلا، میکروکوکوس، انترکوکوس فکالیس، باسیلوس لیچنیفرمیس، اشرشیاکلی، لیستریا مونوسیتوژنز و ... می­باشد لذا باید به فکر یافتن ترکیبات ضد باکتریایی طبیعی بر علیه آن­ها بود. تحقیقات نشان می­دهد پپتیدهای ضد میکروبی می­توانند بر علیه پاتوژن های غذایی موثر باشند و بنابراین بدون داشتن اثرات جانبی نقش مهمی در نگهداری مواد غذایی ایفا کنند (Hintz et al.,2012; Kraszewska et al., 2016). پپتیدهای ضد میکروبی به خانواده جدیدی از آنتی بیوتیک­ها تعلق دارند. مزیت عمده پپتیدهای ضد میکروبی به مکانیسم عمل آن­ها مربوط می­شود که تفاوت عمده­ای با آنتی بیوتیک­های متداول دارند. ﭘﭙﺘﯿﺪﻫﺎی ﺿﺪ ﻣﯿﮑﺮوﺑﯽ ﺑﺮ اﺳﺎس وﯾﮋگی­های ﺑﯿﻮﺷﯿﻤﯿﺎﯾﯽ ﻣﺜﻞ ﺑﺎر ﺧﺎﻟص به دو گروه پپتیدهای کاتیونی و پپتیدهای آنیونی تقسیم می­شوند. اغلب پپتیدهای ضد میکروبی کاتیونی هستند (Marshall, 2003). هر چند مکانیسم دقیق عملکرد آن­ها هنوز به­طور دقیق مشخص نشده است ولی تصور بر آنست که این پپتیدهای باردار مثبت پوشش سلولی باکتریایی که بار منفی دارد را هدف قرار می­دهند. سپس با نفوذ به درون غشای سلول ساختار سلول را تخریب کرده و منجر به تراوش اجزای سیتوپلاسم به بیرون و نهایتا مرگ سلولی می شوند (Bagley, 2014). در حالی که پپتیدهای ضد میکروبی آنیونی ﮔﯿﺮﻧﺪه­ﻫﺎی وﯾﮋه­ای را ﻫﺪف ﻗﺮار داده و ﺑﻪ ﻋﻨﻮان ﺑﺎزدارﻧﺪه­ﻫﺎی اﺻﻠﯽ مسیرهای متابولیکی رفتار می­کنند(Cotter et al., 2013). از میان بیش از 900 پپتید ضد میکروبی ایزوله شده از تعداد زیادی از میکروارگانیسم­ها، پپتیدهای مارپیچ آلفا کاتیونی خطی بیشترین گروه مورد مطالعه بوده­اند. اینها پپتیدهای کوچکی هستند که از 10 تا 45 اسید آمینه بلند زنجیره، هیدروفوب و بازی تشکیل شده اند. این گروه از پپتیدها اغلب در زهر حشرات گزنده مثل زنبورها یافت می شوند. چنین پپتیدهایی به عنوان الگویی برای توسعه پپتیدهای آنتی بیوتیکی جدید و موثر می توانند به کار گرفته شوند(Cerovsky et al., 2009). Lasioglossin­ها گروهی از پپتیدهای ضد میکروبی طبیعی هستند که به تازگی شناسایی شده اند و در زهر زنبور عسل وحشی(Lasioglossum laticeps)  وجود دارند. سه نوع Lasioglossin   از نظر ساختاری شناسایی شده­اند و با اسامی Lasioglossin Ι, ΙΙ, ΙΙΙ نامگذاری شده­اند(Vrablikova et al., 2017). این پپتیدها عملکرد ضد میکروبی بر برخی باکتری­های گرم مثبت و گرم منفی نشان دادند. پپتیدهای Lasioglossin   فعالیت همولیتیک کمی در برابر اریتروسیت­های موش آزمایشگاهی نشان دادند که یک ویژگی مهم برای آن­ها می باشد زیرا مشکل اصلی در کاربرد بسیاری از  پپتیدهای ضد میکروبی توانایی آن­ها برای لیز کردن سلول­های یوکاریوتی می­باشد که به عنوان فعالیت همولیتیکی مطرح می­شود و در این پپتیدها این ویژگی در حداقل می­باشد. از بین سه نوع، Lasioglossin نوع ΙΙΙ بهترین پتانسیل ضد میکروبی، ضد توموری و ضد مخمر کاندیدا را نشان داده است(Vrablikova et al., 2017). در مطالعات پیشین انجام شده اثر ضد میکروبی پپتید Lasioglossin ΙΙΙ که به شکل نوترکیب در فضای پری­پلاسمی سنتز شده باشد بر علیه پاتوژن­های شاخص غذایی بررسی نشده است. از این رو در این تحقیق، با توجه به در دسترس بودن نوع نوترکیب این پپتید از مطالعه دیگر(نتایج گزارش نشده است)، ابتدا  اثر ضد میکروبی این پپتید نوترکیب برعلیه پاتوژن­های اشرشیا کلی، استافیلوکوکوس اورئوس، سالمونلا تیفی موریوم، انتروکوکوس فکالیس و لیستریا مونوسیتوژنز مورد بررسی قرار گرفت و سپس عدم سمیت این پپتید ارزیابی شد تا چشم انداز روشنی در معرفی این پپتید به عنوان نگهدارنده مواد غذایی فراهم گردد.

مواد و روش­ها

باکتری­های استافیلوکوکوس اورئوس (ATCC25923)، سالمونلا تیفی موریوم (ATCC 14028)، انتروکوکوس فکالیس (ATCC 29212) ، لیستریا مونوسیتوژنز (ATCC 19111) و اشرشیا کلی (ATCC 25922) از کلکسیون میکروبی گروه علوم و صنایع غذایی دانشگاه فردوسی مشهد تهیه گردیدند.

پپتید نوترکیب Lasioglossin ΙΙΙ از آزمایشگاه گروه صنایع غذایی دانشگاه فردوسی مشهد تهیه گردید. این پپتید به صورت نوترکیب و با تجمع در فضای پری پلاسمی  در  باکتری E. Coli سویه BL21 ترانسفورم شده با وکتور pET22b نوترکیب، دارنده توالی کدکننده لازیوگلوسین ΙΙΙ، سنتز شد و پس از استخراج پپتید از فضای پری پلاسمی و تخلیص آن، غلظت آن تعیین گردید. سپس پپتید جهت ارزیابی ضدمیکروبی به کار برده شد.

برای تعیین حداقل غلظت مهار کنندگی (MIC[1]) و حداقل غلظت کشندگی ([2]MBC) از روش میکرودایلوشن استفاده گردید (Wikler et al., 2009; Wiegand et al., 2008). برای این منظور ابتدا از باکتری­ها کشت 24 ساعته تهیه شد. پس از تهیه 5/0 مک فارلند از باکتری­ها در محیط مولر هینتون براث (مرک، آلمان)، مقدار 100 میکرولیتر از سوسپانسیون تهیه شده به هر یک از چاهک­های پلیت 96 خانه اضافه شد. سپس به چاهک اول 100 میکرولیتر پپتید اضافه شد و کاملا مخلوط گردید و از آن 100 میکرولیتر برداشته به چاهک بعدی اضافه شدو این رویه را در جاهک­های بعدی ادامه داده به صورتی که سریالی از رقت­های پپتید حاصل شد. کنترل منفی (بدون افزودن باکتری) و کنترل مثبت (بدون افزودن پپتید ) نیز در هر ردیف در نظر گرفته شد. بعد از 16 تا 18 ساعت گرمخانه­گذاری میکروپلیت در دمای C° 37، جذب تمامی چاهک­ها بوسیله الایزا خوان (مدل ELX800 بیوتک، امریکا) در 620 نانومتر اندازه گیری شد. اولین چاهک­هایی که حاوی پپتید بود و جذبی در 620 نانومتر نداشتند و شفاف بوده به عنوان MIC در نظر گرفته شد. به منظور تعیین حداقل غلظت کشندگی نیز 50 میکرولیتر از چاهک­هایی که در آن­ها رشد باکتری صورت نگرفته بود یعنی همان رقت MIC  و رقتهای بالاتر از آن به محیط مولر هینتون آگار (مرک، آلمان) منتقل شد و پس از پخش بوسیله سواپ استریل به مدت 24 ساعت در C° 37 گرمخانه گذاری شدند. پلیت­هایی که حاوی کمترین غلظت از پپتید بودند و همچنین در آن رشدی مشاهده نشد به عنوان MBC در نظر گرفته شدند.

سمیت پپتید روی سلول­های کلیه جنین انسان بررسی شد. تقریبا10³ ×3 سلول در 100 µl محیط DMEM[3] (10% حجمی-حجمی FBS[4]) (سیگما، انگلستان) در هر چاهکِ یک پلیت دارای 96 چاهک کشت داده شدند. سلول ها به مدت 1 شب در دمای C °37  در یک اینکوباتور مرطوب با 5% دی اکسید کربن گرمخانه­گذاری شدند. سلول­ها سپس با پپتید تیمار شدند. سلول­ها به مدت 72 ساعت در دمای C °37  تحت شرایط یکسان گرمخانه­گذاری شدند. تست MTT برای دیدن اثر بازدارندگی پپتید در سلول­های نرمال انجام شد. طی این ارزیابی lµ 10 از رنگ MTT تهیه شده (PBS 5 mg/ml) در هر یک از خانه­ها اضافه شد و به منظور متابولیزه شدن ماده MTT توسط سلول­های زنده و ایجاد بلورهای فورمازان، پلیت96 خانه ای به مدت 4 ساعت در دمای C ⁰37 گرمخانه گذاری شد. سپس محتویات خانه­ها تخلیه و  lµ 150 DMSO [5]( سیگما، انگلستان ) به هر یک از خانه­ها افزوده شد. DMSO حلال بلور­های فورمازان است. افزودن DMSO باعث ایجاد درجه­ی  متفاوتی از شدت رنگ بنفش تا سفید می­شود. شدت رنگ این محلول­ها ، معیاری از تعداد سلول­های زنده در محیط می­باشد. میزان رنگ تولید شده با تعداد سلول­هایی که از نظر متابولیک فعال هستند رابطه مستقیم دارد.  سپس میزان جذب خانه­ها در طول موج nm 570 توسط دستگاه الایزا اندازه­گیری شد (Ghandehari et al.,2015).

در این مطالعه برای تجزیه داده­ها از نرم افزار SPSS.22 استفاده شد. بررسی خواص ضد باکتریایی در 4 تکرار و در قالب طرح کاملا تصادفی انجام شد. برای مقایسه میانگین داده­ها از از آزمون  تحلیل واریانس و آزمون چند دامنه­ای دانکن  در سطح اطمینان 05/0 استفاده شد.

نتایج و بحث

هر روز اثرات زیان­آور نگهدارنده های شیمیایی از جمله عوارض سرطان­زایی و نیز باقی مانده­های سمی بر سلامت انسان به اثبات می­رسد و تقاضا برای مصرف مواد غذایی که عمر ماندگاری آن­ها به صورت طبیعی افزایش می­یابد، بیشتر می­شود. لذا محققین مواد غذایی درصدد جایگزینی آن­ها با نمونه­های طبیعی شده­اند. از طرفی تعداد پاتوژن­های مقاوم به آنتی بیوتیک روز به روز در حال افزایش است و ترکیبات ضد میکروبی موجود برای کنترل عفونت­های باکتریایی جوابگو نمی­باشند (Okuda  et al., 2015). پپتیدهای ضد میکروبی می­توانند جایگزین آنتی بیوتیک­های موچود برای کنترل و مبارزه با عفونت­های باکتریایی باشند. این پپتیدهای ضد میکروبی نه تنها عملکرد ضد باکتریایی دارند  بلکه در بسیاری موارد اثر کشندگی بر روی ویروس­ها و حتی سلول­های سرطانی نشان داده­اند. عملکرد پپتیدهای ضد میکروبی به طور عمده به سطح سلول­های باکتریایی و ترکیب آمینو اسیدی پپتید بستگی دارد. پپتیدهای ضد میکروبی ابتدا به سطح سلول باکتریایی که به احتمال زیاد توسط پیوند الکترواستاتیک بین پپتید کاتیونی و سطح باکتریایی ایجاد می­شود متصل می­شوند. احتمال آن می­رود که پپتیدهای کاتیونی ابتدا توسط مولکول­های لیپوپلی­ساکارید دارای بار منفی موجود در باکتری­های گرم منفی جذب می شوند (Brogden, 2005). هر چند یافته­های Ebbensgaard et al.   (2015) نشان داد که لیپوپلی­ساکارید در باکتری اشرشیا کلی نه فقط در جذب و اتصال پپتیدهای ضد میکروبی به غشای خارجی نقش دارد بلکه به عنوان مانع حفاظتی بر علیه پپتیدهای ضد میکروبی کاتیونی عمل می­کند. زیرا سویه­های باکتریایی اشرشیا کلی جهش یافته­ی دارای نقص در لیپوپلی­ساکارید، حساسیت بیشتری به پپتیدهای ضد میکروبی بکار رفته نشان دادند. که این امر دلالت بر این دارد که لیپوپلی­ساکارید به عنوان جزء ضروری در فعالیت ضد میکروبی پپتیدهای کاتیونی نقش ندارد همچنان­که بسیاری از پپتیدهای ضد میکروبی کاتیونی فعالیت ضد میکروبی بر علیه باکتری­های گرم مثبت که فاقد لیپوپلی­ساکارید هستند نشان دادند (Ebbensgaard et al., 2015).

تعیین فعالیت ضد میکروبی به روش تعیین حداقل غلظت ممانعت کننده (MIC) یکی از پرکاربرد ترین روش­ها است و توسط اکثر محققین به عنوان معیاری برای تعیین فعالیت ضد میکروبی پذیرفته شده است. فاکتورهای متعددی بر روی میزان MIC تاثیر می گذارند از جمله دما، میزان تلقیح و نوع میکروارگانیسم (Lambert, 2000). نتایج مربوط به حداقل غلظت بازدارندگی و حداقل غلظت کشندگی پپتید لازیوگلوسین ΙΙΙ بر روی 5 باکتری پاتوژن در جدول 1 نشان داده شده و با آنتی بیوتیک­های استاندارد مقایسه شده است. نتایج نشان داد کمترین MIC و MBC به باکتری استافیلوکوکوس اورئوس مربوط بود، یعنی این باکتری بیشترین حساسیت به این پپتید را نشان داد. اثر مهار کنندگی این پپتید بر رشد استافیلوکوکوس اورئوس در مقایسه با آنتی بیوتیک­های ونکومایسین، جنتامایسین و سیپروفلو کساسین خیلی بیشتر بود ولی آنتی بیوتیک آمپی سیلین اثر مهار کنندگی بیشتری نسبت به پپتید لازیوگلوسین ΙΙΙ بر روی رشد استافیلوکوکوس اورئوس داشت. اثر مهار کنندگی این پپتید بر رشد سالمونلا تیفی موریوم تقریبا مشابه اثر آنتی بیوتیک سیپروفلوکساسین بود ولی در مقایسه با آنتی بیوتیک­های آمپی سیلین، کافتازیدیم، پیپراسیلین و جنتامایسین اثر مهار کنندگی بیشتری بر رشد سالمونلا تیفی موریوم نشان داد. اثر بازدارندگی پپتید مذکور بر رشد باکتری انتروکوکوس فکالیس از آنتی بیوتیک­های آمپی سیلین، ونکومایسین، جنتامایسین و سیپروفلوکساسین کمتر بود. هر چند اثر کشندگی این پپتید بر انتروکوکوس فکالیس از آنتی بیوتیک­های آمپی سیلین (16µg/ml)، ونکومایسین (256µg/ml)، جنتامایسین (128µg/ml) و سیپروفلوکساسین (16µg/ml) خیلی بیشتر بود. نتایج MIC بر باکتری لیستریا مونوسیتوژنز نشان داد اثر مهار کنندگی پپتید لازیوگلوسین ΙΙΙ بر رشد لیستریا خیلی بیشتر از اثر مهار کنندگی آنتی بیوتیک­های آمپی سیلین، پیپراسیلین و جنتامایسین بود. از بین باکتری­های مورد بررسی مقاوم­ترین باکتری به پپتید لازیوگلوسین ΙΙΙ باکتری اشرشیا کلی بود که هرچند در برابر دو آنتی بیوتیک آمپی سیلین و سیپروفلوکساسین حساستر بود ولی مقاومت بیشتری در برابر آنتی بیوتیک­های کافتازیدیم، پیپراسیلین و جنتامایسین نشان داد. بررسی نتایج MBC نشان داد پپتید لازیوگلوسین ΙΙΙ در مقایسه با آنتی بیوتیک آمپی سیلین(6/1 µg/ml MBC=) اثر کشندگی کمتری بر باکتری استافیلوکوکوس اورئوس نشان داد. از بین باکتری­های مورد آزمون حداقل غلظت مهار کنندگی رشد با حداقل غلظت کشندگی رشد پپتید بر علیه باکتری اشرشیا کلی یکسان بود (CLSI, 2017). پپتید لازیوگلوسین ΙΙΙ همچنین بر روی یوکاریوت های ابتدایی نیز تاثیر بازدارندگی نشان داد به طوری که  مخمر کاندیدا آلبیکانس در حضور لازیوگلوسین ΙΙΙ  LL و لازیوگلوسین ΙΙΙ-D  LLبه ترتیب در غلظت­های µM5/11 و µM21 به مدت 3 روز قادر به رشد بود (Vrablikova et al., 2017).

در پژوهش انجام شده توسط Mishra et al.  (2013) اثر ضد میکروبی پپتید لازیوگلوسین ΙΙΙ که بصورت شیمیایی سنتز شده بود بر باکتری اشرشیا کلی ATCC8739 و استافیلوکوکوس اورئوس ATCC 6538 مورد بررسی قرار گرفت. نتایج MIC برای هر دو پاتوژن 75/1 میکروگرم بر لیتر بود که از نتایج حاصل از پژوهش ما که نوع نوترکیب این پپتید بکار رفته بود  خیلی کمتر بود. همچنین آنالیز انجام شده با میکروسکوپ الکترونی روبشی توسط آن­ها نشان داد که سلول­های باکتریایی تیمار شده با پپتید لازیوگلوسین ΙΙΙ در مقایسه با سلول­های تیمار نشده تفاوت­های آشکاری در مورفولوژی غشایی داشتند. آنالیزهای بعدی آن­ها نشان داد که این پپتید می­تواند باعث تخریب غشای خارجی شود (Mishra et al., 2013). با توجه به این­که مطالعه بر روی اثرات ضد میکروبی این پپتید در ایران و جهان محدود بوده لذا به بررسی موارد مشابه بر روی پپتیدهای دیگر پرداختیم. در مطالعه حاضر نتایج حاکی از آن بود که مقادیر MBC پپتید لازیوگلوسین ΙΙΙ بر علیه باکتری­های استافیلوکوکوس اورئوس، سالمونلا تیفی موریوم، انتروکوکوس فکالیس و لیستریا مونوسیتوژنز تقریبا دو برابر مقادیر MIC بود که این یافته­ها در تطابق با نتایج Ilić et al.  (2013) بود که بر روی فعالیت ضد میکروبی طیف وسیعی از پپتیدهای ضد میکروبی آزمایشاتی انجام دادند. در پژوهشی Slaninová et al (2012) اثر ضد میکروبی پپتید لازیوگلوسین ایزوله شده از زهر زنبور عسل در برابر باکتری­های گرم مثبت و گرم منفی و همچنین سمیت آن­ها را بر علیه سلول­های نرمال و سرطانی انسان بررسی کردند. نتایج نشان داد لازیوگلوسین ΙΙΙ و یکی ازآنالوگ­های آن می­توانند به عنوان داروهای ضد میکروبی بکار روند.  بطوری که سمیت 3 تا 5 برابر بیشتر بر علیه سلول­های سرطانی نسبت به سلول­های نرمال داشتند. آزمایشات in vivo  در موش نیز نشان داد لازیوگلوسین ΙΙΙ ترکیبی فعال و غیر سمی می­باشد. (Slaninová et al., 2012). در مطالعه انجام شده توسط Ebbensgaard et al.  (2015) تاثیر ضد میکروبی پپتیدهای Cap11و Cap18 (که همچون پپتید لازیوگلوسین دارای ساختمان مارپیچ آلفا بودند) بر روی سویه های E.coli در مقایسه با باکتری­های گرم مثبت بیشتر بود در حالی که در این مطالعه تاثیر بازدارندگی پپتید لازیوگلوسین ΙΙΙ بر باکتری E.coli در مقایسه با باکتری­های گرم مثبت کمتر بود هر چند اثر کشندگی پپتید لازیوگلوسین ΙΙΙ بر باکتری  E.coliنسبت به لیستریا و انتروکوکوس بیشتر بود. پپتید ملیتین[6] که از زنبور عسل ایزوله شده بود نیز همچون پپتید لازیوگلوسین ΙΙΙ فعالیت ضد میکروبی خوبی بر علیه باکتری­های پاتوژن گرم مثبت بویژه استافیلوکوکوس اورئوس، انتروکوکوس فکالیس و لیستریا مونوسیتوژنز داشت. به طوری­که MIC ملیتین بر علیه هر سه باکتری استافیلوکوکوس اورئوس ATCC29213، انتروکوکوس فکالیس ATCC29212 و لیستریا مونوسیتوژنز  N22-2 4-2 میکروگرم بر میلی لیتر بود. MIC ملیتین بر علیه باکتری اشرشیا کلی ATCC25922 16 میکروگرم بر میلی لیتر بود که تقریبا دو برابر MIC پپتید لازیوگلوسین ΙΙΙ بر علیه این باکتری بود. به این معنی که قدرت بازدارندگی پپتید لازیوگلوسین ΙΙΙ بر علیه اشرشیا کلی دو برابر قدرت پپتید ملیتین بود. علت قدرت بازدارندگی کمتر پپتید ملیتین بر علیه باکتری اشرشیا کلی وجود غشای خارجی در باکتری های گرم منفی می باشد که در نتیجه میزان نفوذ اجزای هیدروفوب به لایه لیپوپلی­ساکارید را محدود می کند(Ebbensgaard et al., 2015). در پژوهش دیگری که توسط Ilić et al.  (2013) صورت گرفت میزان MIC پپتیدهای ADP1، ADP2  و ADP3 در برابر باکتری اشرشیا کلی ATCC25922 به ترتیب 4-2، 1و 4 میکروگرم بر میلی لیتر بود که از MIC پپتید بکار رفته در پژوهش ما کمتر بود. ولی میزان کشندگی پپتید ADP3 بر روی باکتری اشرشیا کلی با میزان کشندگی پپتید بکار رفته در این پژوهش تقریبا برابر بود. که تاثیر این پپتیدها در مهار رشد باکتری استافیلوکوکوس اورئوس ATCC25923 خیلی کمتر از پپتید لازیوگلوسین ΙΙΙ بود. همچنین میزان مهار پپتید ADP2 بر روی سالمونلا تیفی موریوم خیلی کمتر از پپتید لازیوگلوسین ΙΙΙ بود (Ilić et al., 2013).

آنچه کاربرد پپتیدهای ضد میکروبی را به عنوان یک عامل ضد باکتری در مواد غذایی و استفاده دارویی با مشکل مواجه می سازد سمیت آن­ها در برابر سلول­های یوکاریوت می­باشد. لذا پپتیدهای ضد میکروبی در کنار خاصیت ضد میکروبی قوی، برای کاربردهای غذایی و دارویی باید از نظر عدم سمیت مورد بررسی قرار بگیرند (Lee et al., 2013). در این پژوهش نیز در کنار بررسی ویژگی بازدارندگی رشد و کشندگی پپتید لازیوگلوسین ΙΙΙ بر روی باکتری­های پاتوژن، ویژگی عدم سمیت آن روی سلول­های کلیه جنین انسان نیز مورد بررسی قرار گرفت. غلظت اولیه برای تست عدم سمیت با ارزیابی سمیت پپتید لازیوگلوسین ΙΙΙ تخلیص شده برابر با 1652 میکروگرم بر میلی لیتر بود که در این غلظت که بالاترین مقدار ممکن از پپتید بود هیچ گونه سمیت معناداری مشاهده نشد (P > 0.05). این غلظت از پپتید به ترتیب  429، 383، 292، 5/214 و 5/191 برابر بیشتر از MIC باکتری­های استافیلوکوکوس اورئوس، سالمونلا تیفی موریوم ، انتروکوکوس فکالیس، لیستریا مونوسیتوژنز  و اشرشیا کلی و همچنین به ترتیب 5/214، 5/191، 146، 107 و 5/191 برابر بیشتر از MBC   این باکتری­ها بود. پپتیدهای لازیوگلوسین در مطالعه Cerovsky et al. (2009) اثر سمیت بر روی سلول­های سرطانی در شرایط in vitro نشان دادند. کمترین غلظت سمیت این پپتید بر روی سلول­های مخاطی نرمال موش آزمایشگاهی بود که غلظت آن µM19 بود.

نتیجه گیری

نتایج پژوهش حاضر نشان از قابلیت رقابت پپتید لازیوگلوسین ΙΙΙ با آنتی بیوتیک­های رایج از نظر خاصیت ضد باکتریایی و کشندگی باکتریایی دارد.  با توجه به غلظت چندین برابر بیشتر از MIC  و MBC اعمال شده در تست عدم سمیت پپتید لازیوگلوسین ΙΙΙ  بر روی یک رده سلول انسانی، عدم سمیت پپتید مذکور به اثبات رسید. با ارزیابی­های تکمیلی و انجام تست­های عدم سمیت بر روی رده­های سلولی انسانی دیگر و غلظت­های مطلوب قابل رقابت با ترکیبات ضد میکروبی متداول می توان چشم انداز روشنی را برای این پپتید به عنوان نگهدارنده مواد غذایی در نظر داشت.

سپاسگزاری

این مطالعه با حمایت مالی دانشگاه فردوسی مشهد (معاونت پژوهشی) در قالب طرح شماره 45804/2 انجام گرفت. بدین وسیله مجری طرح از حمایت مالی سپاسگزاری می نماید.

جدول1- میانگین حداقل غلظت مهار کننده رشد و کشندگی پپتید نوترکیب لازیوگلوسین ΙΙΙ در مقایسه با آنتی بیوتیک های متداول بر روی 5 باکتری پاتوژن (CLSI).

Table 1-The average values of MIC and MBC for lasioglossin LL ΙΙΙ recombinant peptide in comparison with commercial antibiotics against five pathogenic bacteria (CLSI).

.

منابع

Bagley C (2014(. Potential role of synthetic AMPs in animal health to combat growing