تاثیر نانوامولسیون صمغ زدو- اسانس آویشن شیرازی در مهار رادیکال‌های آزاد خارج سلولی و بیان ژن‌ NAD (P) H oxidase در گندم

تاثیر نانوامولسیون صمغ زدو- اسانس آویشن شیرازی در مهار رادیکال‌های آزاد خارج سلولی و بیان ژن‌ NAD (P) H oxidase در گندم

فاطمه سهرابی*¹، غلامرضا کاووسی²

¹دانشجوی کارشناسی ارشد بیوتکنولوژی کشاورزی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه شیراز، شیراز، ایران.

²دانشیار پژوهشکده بیوتکنولوژی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه شیراز، شیراز، ایران.

تاریخ دریافت: 27/01/1397، تاریخ پذیرش: 05/06/1397

چکیده

تولید گونه­های فعال اکسیژن به خصوص پراکسید هیدروژن امری اجتناب ناپذیر در متابولیسم هوازی است. از آن­جا که این ترکیبات در غلظت­های متفاوت، بر فرآیندهای گوناگونی در سلول موثر هستند و افزایش بیش از حد آن­ها به تنش­های اکسیدی منجر می­شود، کنترل غلظت آن­ها امری ضروری به نظر می­رسد. در این پژوهش از اسانس آویشن شیرازی با ترکیبات فنولی (تیمول، کارواکرول) فراوان و پلیمر صمغ زدو به منظور کپسوله سازی و تولید نانوامولسیون استفاده گردید. تاثیر نانوامولسیون صمغ زدو- اسانس آویشن شیرازی در مهار رادیکال­های آزاد 2،2-آزینوبیس-(3-اتیل­بنزوتیازولین-6-سولفونیک اسید (ABTS: 2,2-azinobis-3-ethylbenzothiazolin-6-sulfonic acid) و پراکسیدهیدروژن در خارج از سلول و بیان ژن (NOX: NAD(P)H oxidase) با شماره دسترسی AY561153 (بزرگ­ترین تولید کننده گونه­های فعال اکسیژن) مورد بررسی قرار گرفت. نانوامولسیون با محتوای فنول 88 میلی­گرم در گرم، توانایی بالایی در مهار رادیکال­های آزاد ABTS و پراکسید هیدروژن از خود نشان داد. از طرفی نانوامولسیون در غلظت­های 25 و 50 میکروگرم در میلی­لیتر موجب افزایش و در غلظت­های 100، 150 و 200 میکروگرم در میلی­لیتر موجب کاهش بیان ژن NOX گردید. با توجه به نتایج به نظر می­رسد نانوامولسیون در غلظت­های متفاوت بر گونه­های فعال اکسیژن تاثیر داشته و در نتیجه توانایی کنترل تنش­های اکسیدی را دارا است.

واژههای کلیدی: گونه­های فعال اکسیژن، آویشن شیرازی، صمغ زدو، ژن .NAD(P)H oxidase

مقدمه

تولید گونه­های فعال اکسیژن (Reactive oxygen species ROS:) امری اجتناب ناپذیر از متابولیسم هوازی است. این ترکیبات توسط میتوکندری، کلروپلاست، پراکسی­زوم و آنزیم­های NAD (P) H oxidase تولید می­شوند. در این میان آنزیم­های خانواده NOX، واقع در غشای سلولی، به دلیل این که بزرگ­ترین تولیدکنندگان گونه­های فعال اکسیژن هستند، نقش اساسی را در پاسخ­های ایمنی گیاه بازی می­کنند. آن­ها آنیون سوپراکسید را با انتقال الکترون از NAD (P) H به اکسیژن مولکولی تولید می­نمایند ( Sagi and Fluhr, 2006 ). گونه­های فعال در سطح فیزیولوژیکی به عنوان مولکول­های پیام­رسان در بسیاری از فعالیت­های سلولی عمل می­کنند اما در غلظت­های بالا، صدمات جبران ناپذیری را به ماکرومولکول­های زیستی وارد کرده و تنش اکسیدی و مرگ سلول را موجب می­شوند (Nawkar et al., 2013). گیاهان حاوی مجموعه­ای از سیستم­های دفاع آنتی­اکسیدانی آنزیمی (سوپراکسید دیسموتاز، کاتالاز و پراکسیداز­ها) و غیرآنزیمی (اسید آسکوربیک، فنول، فلاونوئید و... ) هستند (Zagorchev et al., 2013). بنابراین جهت کنترل گونه­های فعال در حد فیزیولوژیک و مقابله با تنش­های اکسیدی، تقویت قدرت آنتی­اکسیدانی سلول از یک سو و کنترل آنزیم­های تولید کننده گونه­های فعال اکسیژن از سوی دیگر امری ضروری به نظر می­رسد. در این میان گیاهان دارویی مانند آویشن شیرازی (Zataria multiflora) از خانواده نعناعیان با داشتن ترکیبات فراوان فنولی مانند تیمول و کارواکرول با خواص ضد میکروبی، ضد قارچی و آنتی­اکسیدانی ویژه، بسیار مورد توجه هستند (Kavoosi and Rabiei, 2015). تیمول و کارواکرول مونوترپن­های فنولی با گروه­های عملکردی متیل و ایزوپروپیل در موقعیت پارا نسبت به یکدیگر هستند. تفاوت این دو تنها به دلیل اختلاف موقعیت گروه هیدروکسیل در حلقه فنولی است. ترکیبات فنولی از طریق گروه هیدروکسیل آزاد روی حلقه آروماتیک عمل آنتی اکسیدانی خود را انجام می­دهند. فعالیت آنتی اکسیدانی آن­ها به تعداد گروه­های هیدروکسیل موجود وابسته است (Berger, 2007). با وجود مزایای مختلف، اسانس گیاهان دارویی دارای محدودیت­هایی از جمله ناپایداری، تبخیر و فرار بودن هستند. تولید نانوامولسیون­هایی از اسانس گیاهان دارویی و پلیمرهای زیستی مانند صمغ زدو در برطرف ساختن این نواقص بسیار مفید می­باشد. زدو، صمغی (گروهی از پلی ساکاریدها) اسـت شـفاف، به سه رنگ سفید، زرد و قرمز کـه از درخت بـادام­کـوهی (Amygdalus scoparia) تراوش می­شود. ایـن صـمغ که بـه نام­های صمغ فارسی و شیرازی نیز­ معـروف اسـت جهت کپسوله سازی، امولسیون کننـدگی، بهبود و پایداری بافت در صنایع غذایی کاربرد دارد (Persin et al., 2011). در این پژوهش از یک سو محتوای فنول و توانایی مهار رادیکال­های آزاد 2،2-آزینوبیس-(3-اتیل­بنزوتیازولین-6-سولفونیک اسید (ABTS: 2,2-azinobis-3-ethylbenzothiazolin-6-sulfonic acid) و پراکسید هیدروژن نانوامولسیون صمغ زدو- اسانس آویشن شیرازی (Zedo-ZMO) در خارج از سلول و از سوی دیگر تاثیر این نانوامولسیون را در غلظت­های مختلف بر بیان ژن NAD (P) H oxidase (بزرگ­ترین تولیدکننده گونه­های فعال اکسیژن) بررسی قرار داده شد.

مواد و روش­ها

صمغ زدو از درخت بادام کوهی در اطراف شهرستان­های مرودشت و ارسنجان (استان فارس) جمع آوری شد. نمونه­های حاصل با کمک آسیاب (ناسیونال) پودر شده و از الک 1/0 سانتی­متر عبور داده تا پودر ریز و یکنواختی به دست آید. جهت آماده سازی نانوامولسیون صمغ زدو، یک گرم از پودر را در 80 میلی لیتر آب مقطر در دمای 50 درجه سانتی­گراد حل کرده بعد از سونیکه شدن با امواج مافوق صوت (140 وات) در دمای 30 درجه سانتی­گراد به مدت 5 دقیقه، به نانوامولسیون تولیدی 100 میلی­گرم سورفاکتانت پلی­زوربات 20 (Polysorbate 20, Sigma) اضافه و در پایان در دمای 40 درجه سانتی­گراد، حجم محلول با آب مقطر به 100 میلی­لیتر رسانده شد. بخش­های هوایی آویشن شیرازی را از اطراف شهرستان ارسنجان (استان فارس) تهیه، اسانس گیری از برگ­ها به روش تقطیر آبی با دستگاه کلونجر (Clevenger, Herbal Exir Co., Mashhad, Iran ) به مدت 3 ساعت صورت گرفت. اسانس­ها با سولفات سدیم بدون آب خشک و در دمای 5 درجه سانتى­گراد در شیشه­های تیره رنگ که با فویل آلومینیومی پوشیده شده بود، نگه­داری شدند. به نانوامولسیون صمغ زدو یک میلی­لیتر اسانس آویشن، 100 میلی­گرم پلی­زوربات 20 اضافه و در پایان در دمای 40 درجه سانتی­گراد، حجم محلول با آب مقطر به 100 میلی­لیتر رسانیده شد. نانوامولسیون حاصله تحت نام Zedo-ZMO در دمای 4 درجه نگه­داری شد (El Asbahani et al., 2015). در این آزمایش هر میلی لیتر اسانس معادل یک گرم در نظر گرفته شد. هرچند که اعتقاد بر این است که معیار نمی باشد. از آن­جا که برای تهیه نانوامولسیون صمغ زدو-اسانس آویشن، یک میلی­لیتر معادل یک گرم اسانس استفاده شد، بنابراین غلظت نهایی نانوامولسیون (استوک) معادل یک درصد یا 10 میلی گرم در میلی­لیتر بود. بنابراین استوک را با آب مقطر رقیق کرده تا غلظت­های مختلف 25، 50، 100، 150 و 200 میکروگرم در میلی­لیتر حاصل شوند.

میزان محتوای فنول در نانوامولسیون براساس روش رنگ سنجی فولین– سیوکالتو (Folin-ciocalteu) و استاندارد گالیک اسید انجام شد. 200 میکرولیتر از نانوامولسیون یک درصد یا استاندارد گالیک اسید (500- 0 میکروگرم در میلی­لیتر گالیک اسید در آب مقطر) به یک میلی­لیتر معرف فولین سیوکالتو (10درصد) افزوده، به مدت پنج دقیقه در دمای اتاق شیک و سپس 300 میکرولیتر کربنات سدیم (10درصد) به آن­ها اضافه و جذب در طول موج 765 نانومتر با اسپکتروفتومتر (Spectrophotometer, UV/Vis 2150) خوانده شد (Marinova et al., 2005).

20 میکرولیتر از نانوامولسیون یا استاندارد گالیک اسید به 1میلی­لیتر از محلول رادیکال ABTS (7میلی مولار ABTS، 54/2 میلی­مولار پرسولفات پتاسیم) به رنگ سبز-آبی افزوده و جذب نانوامولسیون در طول موج 734 نانومتر با اسپکتروفتومتر خوانده شد. درصد مهار ABTS با استفاده از فرمول زیر محاسبه می­شود:

100 × A_734ABTS – A_734Test) /A_734ABTS])] =

  =A_734ABTSجذب محلول ABTS در 734 نانومتر، =A_734Testجذب محلول ABTS در حضور نانوامولسیون و یا استاندارد گالیک اسید است.  غلظتی از نانوامولسیون که 50 % رادیکال­­های ABTS را مهار می­کند (IC₅₀: 50% Inhibitory concentration) بر اساس نمودار درصد مهار در برابر غلظت­های مختلف آنتی اکسیدان محاسبه شد (Re et al., 1999).

جهت تعیین فعالیت مهار کنندگی رادیکال پراکسید هیدروژن توسط نانوامولسیون، 20میکرولیتر نانوامولسیون را با یک میلی­لیتر از محلول پراکسید هیدروژن (50 میلی­مولار در 100 میلی­مولار بافر فسفات با 4/7pH=) در 37 درجه سانتی­گراد به مدت 60 دقیقه انکوبه، سپس جذب نانوامولسیون و محلول پراکسید هیدروژن بدون آنتی­اکسیدان در طول موج 230 نانومتر با اسپکتروفتومتر خوانده شد. درصد مهار به صورت زیر محاسبه شد:

100 × A_230blank – A_230test) /A_230blank])]=  

 A_230blank= جذب محلول پراکسید هیدروژن بدون نانوامولسیون، =A_230test جذب محلول حاوی نانوامولسیون و یا استاندارد گالیک اسید است. IC₅₀واکنش نیز محاسبه شد (Kavoosi et al., 2012). بذرهای گندم رقم سیروان از مرکز تحقیقات کشاورزی استان فارس تهیه، پس از ضد عفونی در اتاقک کشت تحت شرایط 16/8 روشنایی/تاریکی، دمای روز/شب 27/24 درجه سانتی­گراد و رطوبت نسبی 60 درصد به مدت 14 روز کشت شدند. وقتی طول برگ­ها به 10 سانتی­متر رسید، گیاهان به مدت سه روز با 100 میلی­لیتر از غلظت­های 25، 50، 100، 150 و 200 میکروگرم در میلی­لیتر نانوامولسیون Zedo-ZMO تیمار و غلظت یک درصد از نانوامولسیون صمغ زدو نیز به عنوان شاهد استفاده شد. پس از گذشت 24 ساعت، برگ­های گندم جهت استخراج RNA و بررسی بیان ژن NOX برداشت و در نیتروژن مایع در دمای 80- درجه سانتی­گراد نگهداری شدند. با استفاده از کیت شرکت دنا زیست، RNA از بافت برگی استخراج شد. کمیت RNA با استفاده از نانودراپ ND1000 (DE, USA Themo Fisher Scientcec, Wilmington) در طول موج 260 نانومتر و کیفیت آن روی ژل آگارز یک درصد بررسی شد (شکل 1). جهت حذف DNA ژنومی از آنزیم DAase1 (Thermo Fisher) استفاده و سنتز cDNA  Thermo Fisher)) بر اساس دستورالعمل انجام گرفت. بررسی بیان ژن NOX با استفاده از دستگاه ترموسایکلر (Line- gene K) و کیت SYBR Premix Ex Taq TM II، (Taraka, Japan) انجام شد. ترکیب واکنش Real time PCR شامل5 میکرولیتر cDNA 5 بار رقیق شده، 10 میکرولیتر 1× QuantiFast SYBER Green PCR Master mix (حاوی SYBER Green، Taq DNA پلیمراز و بافر PCR)، آغازگرهای رفت و برگشت  هرکدام 6/0 میکرولیتر و آب عاری از نوکلئاز 8/3 میکرولیتر در حجم نهایی 20 میکرولیتر فراهم گردید. واکنش PCR مطایق دستورالعمل کیت شامل مرحله واسرشت سازی اولیه در 94 درجه سانتی­گراد (15 دقیقه)، به دنبال آن40 چرخه شامل واسرشت سازی در 94 درجه سانتی­گراد (10 ثانیه)، اتصال در 58 درجه سانتی­گراد (10 ثانیه)، توسعه در 72 درجه سانتی­گراد (30 ثانیه) انجام شد. جهت اطمینان از صحت تکثیر محصولات PCR چرخه­های منحنی ذوب در دمای 90-50 درجه سانتی­گراد با اختلاف 5/0 درجه سانتی­گراد در هر چرخه اجرا شد. محصولات تکثیر Real time PCR روی ژل آگارز بارگذاری شد تا وجود باند صحیح تایید شود (شکل 2). به منظور استاندار نمودن داده­ها از ژن کنترل داخلی 18S rRNA استفاده شد. آغازگرهای مورد استفاده در (جدول 1) توسط نرم افزار AlleleID7 برای ژن هدف NOX و ژن کنترل داخلی 18S rRNA به ترتیب با شماره دسترسی (AY561153 ، Aj272181) در گندم طراحی شدند (Teoh et al., 2013) و سپس نرخ بیان نسبی ژن NOX در حالت تیمار با غلظت­های 25، 50، 100، 150 و 200 میکروگرم در میلی­لیتر نانوامولسیون صمغ زدو-اسانس آویشن نسبت به حالت کنترل (غلظت یک درصد از نانوامولسیون صمغ زدو) با استفاده از فرمول  2^{-[∆CTsample - ∆CTcontrol]} محاسبه شد (Livak and Schmittgen, 2001). آزمایش در قالب طرح کاملاً تصادفی و با سه تکرار انجام و میانگین­ها با استفاده از روش (LSD) در سطح 5 درصد مقایسه شدند.

نتایج و بحث

سنجش محتوای فنول کل نانوامولسیون نشان می­دهد که صمغ زدو هیچ ترکیب فنولی نداشته اما اسانس آویشن شیرازی دارای 2 ± 88 میلی­گرم در گرم مواد پلی فنولی بود.

شکل 1- بررسی کیفیت RNA روی ژل آگارز 1%.

Figure 1- Evaluation of RNA quality on agarose gel 1%.

شکل2- بررسی محصول Real time Pcr روی ژل آگارز 1%.

Figure 2- Evaluation of Real time Pcr production on agarose gel 1%.

جدول 1- آغازگرهای استفاده شده در واکنش .Real time PCR

Table 1- Primers in Real time PCR reaction.

میزان فنول در این نانوامولسیون­ به دلیل مونوترپن­های حلقوی نظیر تیمول و کارواکرول است (Lee et al., 2005).

صمغ زدو هیچ گونه فعالیت آنتی­اکسیدانی نداشته  است و توانایی مهار رادیکال ABTS توسط نانوامولسیون با 32 = IC₅₀ میلی­گرم در میلی­لیتر، امری وابسته به غلظت است. اضافه کردن آنتی­اکسیدان­ها به کاتیون ABTS موجب کاهش آن به ABTS غیر­رادیکالی در نتیجه کاهش جذب در 734 نانومتر می­شود (جدول 2). کاهش جذب در 734 نانومتر به طور مستقیم مربوط به حضور ترکیبات فنولی در گیاهان دارویی است (Huang et al., 2010). مطالعات فراوانی همبستگی مثبتی میان مونوترپن­های فنولی، تیمول، کارواکرول، فلاونوئید­ها، ترکیبات آلکالوئیدی و مهار رادیکال ABTS را نشان می­دهند (Huang et al., 2010; Karimian et al., 2012).

صمغ زدو هیچ گونه فعالیت آنتی­اکسیدانی نداشته و توانایی مهار رادیکال پراکسید هیدروژن توسط نانوامولسیون با 70 = IC₅₀ میلی­گرم در میلی­لیتر، امری وابسته به غلظت است (جدول 3). توانایی مهار پراکسید هیدروژن، توسط ترکیبات مونوترپن فنولی، توسط سایر پژوهش­ها مورد تایید قرار گرفته است (Katalinic et al., 2006; Huang et al., 2011).

جدول 2- غلظتموثر نانوامولسیون صمغ زدو، صمغ زدو- اسانس آویشن­شیرازی در مهار رادیکال­های .ABTS

Table 2- Effective concentration of zedo gum, zedo gum-  Zataria multiflora essential (ZMEO) nanoemulsion for inhibition of ABTS radicals.

داده­ها به صورت میانگین ± انحراف معیار با حداقل سه تکرار مستقل بیان شده اند. (IC₅₀)، غلظتیاز نانوامولسیون است که 50 % رادیکال­­هایABTS را مهار می­کند. شاخص آنتی اکسیدان با تقسیم 1000 به IC₅₀  محاسبه می­شود. اکی­والان (معادل) گالیک اسید از طریق تقسیم IC₅₀ مهار رادیکال ABTS مربوط به گالیک اسید بر IC₅₀مهار رادیکال ABTS مربوط به آنتی اکسیدان­های آزمایش شده محاسبه می­شود.

Data represent mean ± standard deviation from at least three sets of independent repeats. (IC₅₀), The concentrations of nanoemulsion that were inhibited 50% ABTS radicals. Antioxidant index was calculated by dividing 1000 to IC₅₀. Galic acids equivalents were calculated by dividing IC50 of galic acid for ABTS^•inhibition to IC50 of tested antioxidant for inhibition of ABTS^• radical.

پراکسید هیدروژن با وجود این که، رادیکال آزاد نیست، توسط واکنش­های فنتون و هابر-وایز به رادیکال هیدروکسیل (از خطرناک­ترین رادیکال­های آزاد) تبدیل می­شود (Fenton,1894; Haber and Weiss, 1934). بنابراین مهار پراکسید هیدروژن جهت کنترل تنش اکسیدی امری لازم به نظر می­رسد.

با توجه به (شکل 3)، اثر غلظت­های گوناگون نانوامولسیون صمغ زدو- اسانس آویشن بر بیان ژن NOX در سطح پنج درصد معنی دار بود. بیان ژن NOX در غلظت 25 میکروگرم در میلی­لیتر روندی افزایشی داشته و در غلظت 50 به حداکثر خود رسیده است. از غلظت 100 بیان کاهش یافته تا جایی که در غلظت­های 150 و 200 بیان ژن به کمتر از حالت قبل از تیمار رسید.

جدول 3- غلظتموثر نانوامولسیون صمغ زدو، صمغ زدو-اسانس آویشن شیرازی در مهار رادیکال­های پراکسیدهیدروژن.

Table 3- Effective concentration of zedo gum, zedo- Zataria multiflora essential oil (ZMEO) nanoemulsion for inhibition of hydrogen peroxide radicals.

داده­ها به صورت میانگین ± انحراف معیار با حداقل سه تکرار مستقل بیان شده اند. (IC₅₀)، غلظتی از نانوامولسیون است که 50 % رادیکال­های پراکسید هیدروژن را مهار می­کند. شاخص آنتی اکسیدان با تقسیم 1000 به IC₅₀  محاسبه می­شود. اکی­والان (معادل) گالیک اسید از طریق تقسیم IC₅₀ مهار رادیکال پراکسید هیدروژن مربوط به گالیک اسید بر IC₅₀مهار رادیکال پراکسید هیدروژن مربوط به آنتی اکسیدان آزمایش شده محاسبه می­شود.

Data represent mean ± standard deviation from at least three sets of independent repeats. (IC₅₀), The concentrations of nanoemulsion that were inhibited 50% hydrogen peroxide radicals. Antioxidant index was calculated by dividing 1000 to IC₅₀. Galic acids equivalents were calculated by dividing IC₅₀ of galic acid for hydrogen peroxide inhibition to IC₅₀ of tested antioxidant for inhibition of hydrogen peroxide.

شکل 3- تاثیر غلظت­هایمختلف (0، 25، 100، 150 و 200 میکروگرم در میلی­لیتر) نانوامولسیون صمغ زدو- اسانس آویشن شیرازی  بر بیان ژن NOX.

Figure 3- Effect of different concentrations (0, 25, 100, 150 and 200 µg/ml) of zedo- ZMO nanoemulsion on expression of NOX gene.

 با توجه به نتایج، تاثیر نانوامولسیون صمغ زدو- اسانس آویشن بر بیان ژن NOX  امری وابسته به غلظت است. جهت تعیین چگونگی تاثیر نانوامولسیون صمغ زدو- اسانس آویشن بر ژن­های خانواده NOX در ابتدا باید به چگونگی تنظیم ژن­های این خانواده توجه کرد. بر هم­کنش میان ژن­های NOX و مولکول­های پیام رسان، جهت فعال سازی این ژن­ها به دو روش وابسته به فسفریلاسیون و مستقل از فسفریلاسیون که هر دو با همکاری یکدیگر در تنظیم فعالیت ژن NOX در گیاه موثر هستند صورت می­پذیرد (Mersmann et al., 2010). افزایش بیان ژن NOX در غلظت­های کم نانوامولسیون صمغ زدو-اسانس آویشن شیرازی را می­توان به تیمول (از مهم­ترین اجزای تشکیل دهنده اسانس) نسبت داد. تیمول در غلظت­های اندک با تاثیر بر افزایش نفوذ پذیری غشای سلولی به یون کلسیم، آزاد سازی کلسیم از فسفولیپاز C و کانال­های کلسیم موجب افزایش محتوای کلسیم درون سلولی می­شود. کلسیم با فعال سازی پروتئین­های کیناز وابسته به کلسیم CDPKs (calcium-dependent protein kinases) و CBL (Calcineurin B-like) و کالمودولین CaM (calmodulin) ژن NOX را به صورت مستقیم فسفریله و فعال می­کند و یا با اتصال مستقیم به صورت مستقل از فسفریلاسیون به EF-Hand در انتهای آمین ژن NOX، در افزایش بیان ژن دخیل است (Mersmann et al., 2010). کاهش بیان ژن در غلظت­های 100، 150 و 200 را می­توان به چند دلیل دانست. از طرفی مواد فعال گیاهی مانند تیمول و کارواکرول دارای نقشی دو گانه هستند، به این صورت که این ترکیبات در غلظت­های پایین اثرات مفید دارویی و در غلظت­های بالاتر اثرات سمی از خود نشان می­دهند. آن­ها با تخریب غشای سلولی از فعالیت آنزیم NOX جلوگیری می­کنند. ترکیبات فنولی گیاهان دارویی در غلظت­های بالا اکسید شده و تولید رادیکال­های فنوکسیل می­کنند. این رادیکال­ها مانند سایر گونه­های فعال اکسیژن و نیتروژن دارای اثرات سمی هستند (Mersmann et al., 2010). از طرف دیگر پروموتر ژن NOX دارای عناصر پاسخ دهنده به بسیاری از هورمون­ها از جمله اتیلن، آبسزیک اسید و سالسیلیک اسید است. این کاهش بیان می­تواند به دلیل تاثیر پراکسید هیدروژن تولیدی و تجمع یافته، بر روی هورمون­های گیاهی از جمله آبسیزیک اسید، به منظور کاهش بیان آنزیم و جلوگیری از تنش اکسیدی و پیامدهای آن صورت پذیرد (Belkadhi et al., 2015).

از آن­جا که گونه­های فعال اکسیژن به ویژه پراکسید هیدروژن (به دلیل اندازه کوچک و قدرت انتشار بالا) در سلول مانند شمشیری دو لبه در غلظت­های پایین مانند مولکول­های پیام رسان در فرایندهای رشدی، ایمنی و در غلظت­های بالا در آسیب به ماکرو مولکول­های سلولی موثر هستند، کنترل آن­ها امری ضروری به نظر می­رسد. نتایج نشان می­دهند که نانوامولسیون­های صمغ زدو- اسانس آویشن شیرازی با ترکیبات مونوترپن حلقوی (تیمول و کارواکرول)، دارای خواص بالقوه جهت مهار رادیکال­های آزاد (ABTS، پراکسیدهیدروژن) هستند، همچنین توانایی تغییر بیان ژن NOX را در غلظت­های متفاوت دارند. در نتیجه ما می­توانیم از آن به عنوان آنتی­اکسیدانی طبیعی جهت مهار تنش اکسیدی بهره جوییم. با این حال، تعیین غلطت مناسب و موثر نانوامولسیون صمغ زدو-اسانس آویشن جهت کنترل تنش­های اکسیدی، نیازمند بررسی تاثیر این نانوامولسیون بر آنزیم­های سوپراکسید دیسموتاز، کاتالاز، پراکسیداز­ها (آسکوربات پراکسیداز، گلوتاتیون پراکسیداز و...) که در تولید و مهار گونه­های فعال اکسیژن دخیل هستند می­باشد.