محلول‌سازی و تا‌خوردگی مجدد اجسام اینکلوژن پروتئین نو‌ترکیب پوششی ویروس برگ باد‌بزنی مو تولید شده در Escherichia coli

نوع مقاله : مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 گروه بیماری شناسی گیاهی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه تربیت مدرس، تهران

2 گروه بیوفیزیک، دانشکده علوم زیستی، دانشگاه تربیت مدرس

3 گروه ویروس شناسی، دانشگاه واخنینگن، واخنینگن، هلند

4 دانشگاه تربیت مدرس

چکیده

هدف: سطوح بالای بیان ژن‌­های خارجی در سلول‌­های میزبان به ویژه در باکتری‌­ها اغلب منجر به تشکیل اجسام اینکلوژن[1] می­شود. وجود اسید­آمینه سیستئین در ساختار پروتئین­ها به تشکیل این اندامک نیز کمک می­کند. پیوند­های دی­سولفیدی درون و بین­مولکول­های پروتئین غنی از سیستئین پوششی ویروس برگ باد­بزنی مو باعث تشکیل اجسام اینکلوژن پس از بیان در Escherichia coli می­شود. از این­رو به منظور به­دست آوردن پروتئین نو­ترکیب با ساختار طبیعی، ضروری است پروتئین­های تولید شده در سلول باکتری به شکل محلول در­آیند.
مواد و روش: در مطالعه حاضر برای تا­خوردگی مجدد ساختار پروتئین­ها از حلال آمفی­پاتیک 2 متیل 2،4پنتان دیول (MPD) در حضور سدیم دو­دسیل سولفات (SDS) استفاده شد. به این منظور ابتدا اجسام اینکلوژن حاوی پروتئین پوششی نا­محلول ویروس برگ باد­بزنی مو با استفاده از عامل دناتوره کننده سدیم دو­دسیل سولفات محلول شد. سپس پروتئین پوششی محلول با استفاده از روش کروماتوگرافی اندازه[2] خالص­سازی شد و در نهایت پروتئین­های پوششی خالص با استفاده از روش MPD/SDS تا­خورده شد­ند.
نتایج: تصاویر میکروسکوپ الکترونی عبوری تا­خوردگی مجدد ذرات شبه­ویروسی برگ باد­بزنی مو را تایید کرد.
نتیجه گیری: به نظر می­رسد حلال MPD سبب تعدیل خواص دناتوره کننده سدیم دو­دسیل سولفات شده و به این ترتیب روشی ساده، کار­آمد و موثر برای تا­خوردگی مجدد پروتئین پوششی غنی از سیستئین ویروس برگ باد­بزنی مو معرفی ­شد.



[1]- inclusion body


[2]- size exclusion chromatography

کلیدواژه‌ها


عنوان مقاله [English]

Solubilization and Refolding of Inclusion Body of Grapevine fanleaf virus-coat Protein Produced in E. coli

نویسندگان [English]

  • Razieh Yazdani 1
  • Seyed Shahriar Arab 2
  • Afshin Hassani-Mehraban 3
  • Masoud Shams-bakhsh 4
1 Plant Pathology Department, Faculty of Agriculture, Tarbiat Modares University, Teheran, Iran
2 Department of Biophysics, Faculty of Biological Sciences Tarbiat Modares University, Tehran, Iran
3 Laboratory of Virology, Wageningen University, Droevendaalsesteeg 1,6708 PB, Wageningen, The Netherlands
4 Tehran-Iran
چکیده [English]

Objective
High level expression of recombinant protein in Escherichia coli often results in aggregation of the expressed protein molecules into inclusion bodies. Cysteines in the protein contribute to this process. Intermolecular and intramolecular disulfide bonds formation in Grapevine fanleaf virus (GFLV)-coat protein (CP), a cysteine-rich protein, and lead to aggregation when the recombinant protein was overexpressed in E. coli. Hence, aggregated proteins should be solubilized and allowed to refold to obtain native- or correctly- folded recombinant proteins.
 
Materials and methods
In this paper, SDS/MPD method used as a unique approach to refold the structure some protein in the presence of the denaturing agent, Sodium Dodecyl Sulfate (SDS). This was made possible by addition of the amphipathic solvent 2,4-Methyl-2-PentaneDiol (MPD), used as protecting but also as refolding agent for these proteins. For this purpose, the inclusion bodies containing insoluble proteins of GFLV CP were solubilized by denaturing with SDS, then the soluble proteins were purified by the size exclusion chromatography, and finally, the purified proteins were refolded using SDS/MPD method.
 
Results
Transmission electron microscopy images confirmed the reassembly GFLV VLPs using SDS/MPD method.
 
Conclusions
MPD modulate the denaturing properties of SDS, therefore, for the first time, a simple and effective method to refolded GFLV VLP from the SDS-denatured state.
 
 
 
Yazdani R, Arab SS, Hassani-Mehraban A, Shams-Bakhsh M (2019) Solubilization and refolding of inclusion body of Grapevine fanleaf virus-coat protein produced in E. coli. Agricultural Biotechnology Journal 11 (1), 151-167. 
 
Agricultural Biotechnology Journal 11 (1), 151-167.
DOI: 10.22103/jab.2019.13125.1090
Received:  January 24, 2019; Accepted: April 28, 2019
© Faculty of Agriculture, Shahid Bahonar University of Kerman-Iranian Biotechnology Society

کلیدواژه‌ها [English]

  • cysteine-rich protein
  • size exclusion chromatography
  • transmission electron microscopy