بررسی امکان بیان ژن آلترنان سوکراز در گیاه چغندرقند برای تولید بیوپلیمر آلترنان

نوع مقاله : مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 دانشگاه لرستان

2 گروه زراعت و اصلاح نباتات، دانشکده کشاورزی، دانشگاه لرستان، خرم آباد

چکیده

هدف: باکتری­های اسید لاکتیک با استفاده از ساکارز موجود در محیط خارج سلولی و با بیان آنزیم­های گلیکوزیل ترانسفراز، بیوپلیمرهای ارزشمندی مانند آلترنان تولید کنند که در صنعت و پزشکی کاربرد دارند. بنابراین در مطالعه حاضر به دلیل اهمیت این بیوپلیمرها در صنعت و پزشکی، ژن کد کننده­ آنزیم آلترنان سوکراز باکتری Leuconostoc mesenteroides به گیاه چغندرقند منتقل گردید.
مواد و روش­ها: ژن کد کننده­ آنزیم آلترنان سوکراز (Asr) از ژنوم باکتری Leuconostoc mesenteroides جداسازی و پس از همسانه­سازی در یک ناقل بیانی به وسیله اگروباکتریوم به گیاه چغندرقند منتقل گردید. از تکنیک­های مولکولی برای بررسی گیاهان تراریخت و آنالیز شیمیایی قندها استفاده شد.
نتایج: از مجموع 131 ریزنمونه تراریزش شده، تنها سه گیاه تراریخت تولید شد که کارایی تراریزش 30/2 درصد را نشان داد. الحاق ژن کدکننده­ آنزیم آلترنان سوکراز در ژنوم گیاهان تراریخت و همچنین بیان این ژن به ترتیب توسط آزمون PCR اختصاصی و RT-PCR نیمه کمی تائید شد. آنالیز قند گیاهان تراریخت چغندر قند نشان داد که گیاه شاهد با میزان پل (ساکارز) 6/19 درصد دارای ساکارز بیشتری نسبت به گیاهان تراریخت با میزان پل متوسط 4/14 بود. همچنین میزان بریکس در گیاهان تراریخت پایین­تر از گیاهان شاهد بود و میزان کاهش قند (ساکارز) در گیاه تراریخت دارای ژن Asr نسبت به شاهد در حدود 1/36 درصد بود.
نتیجه­گیری: نتایج این مطالعه نشان داد که آنزیم آلترنان سوکراز باکتریایی قادر است میزان mg/g FW 6/36 بیوپلیمر آلترنان را در ریشه­های چغندرقند تولید کند و مقادیر قابل توجهی از ساکارز ریشه را به بیوپلیمر آلترنان با کاربردهای صنعتی و دارویی تبدیل کند.

کلیدواژه‌ها


عنوان مقاله [English]

A study of possibility of expression of an alternasucrase gene in sugar beet to produce alternan biopolymer

نویسندگان [English]

  • Farhad Nazarian-Firouzabadi 1
  • Ahmad Ismaili 2
  • Dariush Goodarzi 2
1 Agronomy and plant Breeding Department, Faculty of Agriculture, Lorestan University, Khorramabad
2 Agronomy and plant Breeding Department, Faculty of Agriculture, Lorestan University, Khorramabad
چکیده [English]

Objective
Lactic acid bacteria (LAB) synthesize valuable industrial and pharmaceutical important biopolymers, such as Alternan, by expressing glycosyltransferase enzymes by utilizing extracellular sucrose. In this study, due to the importance of such versatile biopolymers in the industry and medicine, a gene encoding an Altranansucrase (Asr) was introduced to sugar beet plants.
 
Materials and methods
A gene encoding the Asr gene was isolated from Leuconostoc mesenteroides bacterium and introduced to sugar beet plants by using Agrobacterium-mediated transformation. Molecular techniques were used to analyse transgenic plants and sugar content of sugar beet lines.
 
Results
Out of 131 transformed explants, only three transgenic plants were produced, showing a transformation efficiency of 2.3%. The Asr gene integration in transgenic plants genome and expression were confirmed by specific PCR and semi-quantitative RT-PCR analysis, respectively. Sugar analysis of sugar beet transgenic plants showed that control plants with a 19.6% brix value (Sucrose) had more sucrose than transgenic plants with an average brix value of 14.4%. Brix in transgenic plants was lower than that of control plants. The amount of sugar (sucrose) in the transgenic asr-expressing plants reduced by 36.1% relative to the untransformed control plants.
 
Conclusions
The results of this study showed that Altrenansucrase can convert substantial amount of sugar beet sucrose into Alternan biopolymer, producing 36.6 mg/g FW alternan biopolymer with pharmaceutical and industrial applications.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Bacterium
  • Biotechnology
  • Gene transfer
  • Gene manipulation
  • Glucansucrases
  • Sugar plants
خادمی میترا، نظریان فیروزآبادی فرهاد (1392) تاثیر دو نوع هورمون بر تولید برگ های حاوی پایه جوانه در روش باززایی مستقیم گیاه چغندرقند. فن­آوری زیستی در کشاورزی 4(1)، 52-47.
شرفی، رضا (1392) همسانه­سازی ژن کد­کننده­ی آنزیم موتان سوکراز از باکتری Streptococcus doweni. Mfe 28 برای بیان در گیاه چغندرقند. پایاننامه کارشناسی ارشد، دانشگاه لرستان.
موسوی الهام، نظریان فیروزآبادی فرهاد، اسماعیلی احمد (1395) بررسی طیف آنتی بیوگرام و ژن های مرتبط با بیماری زایی دو سویه انتروکوکوس فاسیوم جداسازی شده از شیره درخت بلوط .(Quercus brantii var. persica)مجله دانشگاه علوم پزشکی مازندران 26(146)، 46-31.
References
Ahmadi M, Nazarian-Firouzabadi F, Ismaili A et al. (2018) Production of microbial mutan polysaccharide by expression of a mutansucrase gene (gtfI) in sugarcane. Mol Breed 38, 149.
Arguello-Morales MA, Remaud-Simeon M, Pizzut S et al. (2000) Sequence analysis of the gene encoding alternansucrase, a sucrose glucosyltransferase from Leuconostoc mesenteroides NRRL B-1355. FEMS Microbiol Lett 182, 81-85.
Årsköld E, Svensson M, Grage H et al. (2007) Environmental influences on exopolysaccharide formation in Lactobacillus reuteri ATCC 55730. Inter J food Microbiol 116, 159-167.
Bauer R, Basson CE, Bekker J et al. (2012) Reuteran and levan as carbohydrate sinks in transgenic sugarcane. Planta 236, 1803-1815.
Cote GL (1992) Low-viscosity α-d-glucan fractions derived from sucrose which are resistant to enzymatic digestion. Carbohydrate Polymer 19, 249-252.
Falconer DJ, Mukerjea R, Robyt JF (2011) Biosynthesis of dextrans with different molecular weights by selecting the concentration of Leuconostoc mesenteroides B-512FMC dextransucrase, the sucrose concentration, and the temperature. Carbohydrate Res 346, 280-284.
Freitas F, Alves VD, Reis MA (2011) Advances in bacterial exopolysaccharides: from production to biotechnological applications. Trend Biotechnol 29, 388-398.
Galle S, Schwab C, Arendt E et al. (2010) Exopolysaccharide-forming Weissella strains as starter cultures for sorghum and wheat sourdoughs. J Agric Food Chem 58, 5834-5841.
Gangoiti J, Pijning T, Dijkhuizen L (2018) Biotechnological potential of novel glycoside hydrolase family 70 enzymes synthesizing α-glucans from starch and sucrose. Biotechnol Adv 36, 196-207.
Gould J (1997) Transformation of the cereals using Agrobacterium. Recombinant Gene Expression Protocols, 491-501.
Hall RD, Riksen-Bruinsma T, Weyens GJ et al. (1996) A high efficiency technique for the generation of transgenic sugar beets from stomatal guard cells. Nature Biotechnol 14, 1133-1138.
Hehre EJ (1943) Comparison of Dextran Synthesis by Leuconostoc Enzyme with Starch Synthesis by Potato Phosphorylase. Proc Society Experim Biol Med 54, 240-241.
Hisano H, Kimoto Y, Hayakawa H et al. (2004) High frequency Agrobacterium-mediated transformation and plant regeneration via direct shoot formation from leaf explants in Beta vulgaris and Beta maritima. Plant Cell Report 22, 910-918.
Johansson S, Diehl B, Christakopoulos P et al. (2016) Oligosaccharide synthesis in fruit juice concentrates using a glucansucrase from Lactobacillus reuteri 180. Food Bioprod Process 98, 201-209.
Katina K, Maina NH, Juvonen R et al. (2009) In situ production and analysis of Weissella confusa dextran in wheat sourdough. Food Microbiol 26, 734-743.
Kavita K, Mishra A, Jha B (2011) Isolation and physico-chemical characterisation of extracellular polymeric substances produced by the marine bacterium Vibrio parahaemolyticus. Biofouling 27, 309-317.
Khademi M, Nazarian-Firouzabadi F (2014) The Influence of Two Types of Hormones (BA and NAA) on Appearance of Shoot Base Explants in Sugar Beet (Beta vularis L.). Agric Biotechnol J 4, 47-52 (In Persian).
Kok-Jacon GA, Vincken J-P, Suurs LC et al. (2007) Expression of alternansucrase in potato plants. Biotechnol Lett 29, 1135-1142.
Kralj S (2004) Glucansucrases of Lactobacilli: Characterization of genes, enzymes, and products. Ph.D. thesis. In: Rijksuniversiteit Groningen. University of Groningen.
Kralj S, van Geel-Schutten GH, Dondorff MMG et al. (2004) Glucan synthesis in the genus Lactobacillus: isolation and characterization of glucansucrase genes, enzymes and glucan products from six different strains. Microbiol 150, 3681-3690.
Krishnaswamy NR (2011) Carbohydrate chemistry from Fischer to now. Resonance 16, 620-639.
Lacaze G, Wick M, Cappelle S (2007) Emerging fermentation technologies: development of novel sourdoughs. Food Microbiol 24, 155-160.
Leathers TD, Nunnally MS, Cote GL (2002) Modification of alternan by novel Penicillium spp. J Indust Microbiol Biotechnol 29, 177-180.
Monchois V, Willemot R-M, Monsan P (1999) Glucansucrases: mechanism of action and structure-function relationships. Federation of European Microbiological Societies. Microbiol Rev 23, 131-151.
Moulis C, Joucla G, Harrison D et al. (2006) Understanding the polymerization mechanism of glycoside-hydrolase family 70 glucansucrases. J Biol Chem 281, 31254-31267.
Mousavi E, Nazarian-Firouzabadi F, Ismaili A (2017) Antibiogram Analysis and Detection of Pathogenicity Genes in Two Strains of Enterococcus faecium Isolates from Oak Sap (Quercus brantii var. Persica). J Mazandaran Univ Medic Sci 26, 31-46 (in Persian).
Murashige T, Skoog F (1962) A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures. Physiologia Plantarum 15, 473-497.
Norouzi P, Malboobi MA, Zamani K, Yazdi-Samadi H (2005) Using a competent tissue for efficient transformation of sugarbeet (Beta vulgaris L.). In Vitro Cell Develop Biol Plant 41,11-16.
O'Connor JJ, Robertson EF (2003) William Sealy Gosset. MacTutor History of Mathematics archive, University of St Andrews.
Rehm BH (2010) Bacterial polymers: biosynthesis, modifications and applications. Nature Rev Microbiol 8, 578-592.
Roberfroid M (2007) Prebiotics: the concept revisited. J Nut, 830S–837S.
Santos M, Teixeira J, Rodrigues A (2000) Production of dextransucrase, dextran and fructose from sucrose using Leuconostoc mesenteroides NRRL B512 (f). Biochem Engineer J 4, 177-188.
SAS Institute (2011) SAS version 9.3. SAS Institute Inc, Cary.
Sharafi R (2013) Cloning Of Gene Encoding mutansucrase enzyme (Gtfi) from Streptococcus downei. Mfe 28 for expression in sugar beet plants. MsC thesis, Lorestan University.
 
Sidebotham RL (1974) Dextrans. Adv Carbohydrate Chem Biochem 30, 371-444.
Suresh Kumar A, Mody K, Jha B (2007) Bacterial exopolysaccharides–a perception. J Basic Microbiol 47, 103-117.
Van Geel-Schutten GH, Faber EJ, Smit E et al. (1999) Biochemical and Structural Characterization of the Glucan and Fructan Exopolysaccharides Synthesized by theLactobacillus reuteri Wild-Type Strain and by Mutant Strains. Appl Environment Microbiol 65, 3008-3014.
Vasanthan T, Yeung J, Hoover R (2001) Dextrinization of Starch in Barley Flours with Thermostable alpha-Amylase by Extrusion Cooking. Starch-Starke 53, 616-622.
Verpoorte R (2000) Secondary metabolism. In: Metabolic engineering of plant secondary metabolism. Springer. pp. 1-29.
Vuyst L, Degeest B (1999) Heteropolysaccharides from lactic acid bacteria. Federation of European Microbiological Societies. Microbiol Rev 23, 153-177.
Whalley HCSD (1964) ICUMSA methods of sugar analysis : official and tentative methods recommended by the International Commission for Uniform Methods of Sugar Analysis (ICUMSA). (H.C.S. De Whalley edn), Elsevier Pub. Co., Amsterdam.
Yan M, Han J, Xu X et al. (2016) Gsy, a novel glucansucrase from Leuconostoc mesenteroides, mediates the formation of cell aggregates in response to oxidative stress. Sci Report 6, 38122.
Yan M, Wang B-h, Xu X et al. (2018) Molecular and functional study of a branching sucrase-like glucansucrase reveals an evolutionary intermediate between two subfamilies of the GH70 enzymes. Appl Environ Microbiol 84, e02810-02817.