همسانه‌سازی و بیان آنزیم نوترکیب زایلاناز (xynA) در باکتری E. coli

نوع مقاله : مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 گروه بیوتکنولوژی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه شهرکرد، استان چهارمحال و بختیاری، ایران

2 استادیار، گروه بیوتکنولوژی و اصلاح نباتات، دانشکده کشاورزی، دانشگاه شهرکرد، شهرکرد، ایران

3 استادیار، گروه علوم دامی و طیور، دانشکده کشاورزی، دانشگاه شهرکرد، شهرکرد، ایران.

4 استاد، گروه بیوشیمی، دانشکده علوم پایه، دانشگاه شهرکرد، شهرکرد، ایران.

چکیده

هدف: امروزه، افزایش جهانی قیمت ذرت در جیره طیور سبب جایگزینی گندم به جای ذرت شده است. اما وجود پلی‌ساکاریدهای غیرنشاسته‌ای در دیواره سلولی مانع جذب ترکیبات غذایی موجود در گندم توسط طیور می‌گردند. یکی از روش‌های حذف پلی‌ساکاریدهای غیرنشاسته‌ای موجود در گندم استفاده از آنزیم زایلاناز در جیره‌ی غذای طیور می‌باشد. زایلانازها سبب شکسته شدن پیوند اندو بتا (4-1) آرابینوزایلان در دیواره سلولی گندم می‌شود. هدف از این پژوهش تولید آنزیم نوترکیب مقاوم به حرارت زایلاناز در باکتری E. coli، به عنوان مکمل جیره غذایی طیور می‌باشد.
مواد و روش‌ها: در این پژوهش ژن مقاوم به حرارت زایلاناز (xynA) در یک سیستم بیان ترشحی باکتریایی شامل: توالی‌ شاین-دالگارنو، سیگنال‌پپتید ترشحی Usp45 و پروموتر T7 در پلاسمیدpET-22b (+) از باکتریE. coli  سویه BL21 (DE3) با استفاده از روش شوک حرارتی کلون شد. جهت القای بیان ژن نوترکیب زایلاناز از القاگر IPTG در زمان‌های‌ مختلف استفاده گردید. همچنین، بررسی شاخص‌های کاتالیتیکی نیز طبق روش DNS صورت پذیرفت.
یافته‌ها: نتایج حاصل از کلونی PCR وجود توالی ژن نوترکیب زایلاناز به طول bp 743 را بر روی ژل آگارز 1 درصد تأیید نمود. ژل اکریل‌آمید SDS-PAGE، حضور پروتئین با وزن مولکولی kDa 27 را نشان داد. همچنین میزان فعالیت پروتئین نوترکیب به مقدار 47/189 (unit/ml) با استفاده از روش DNS در دمای بهینه °C65 و 6 pH= تعیین گردید. علاوه بر این، نتایج منحنی میکائیلیس-منتن میزان ثابت میکائیلیس (Km) و حداکثر سرعت واکنش (Vmax) را برای آنزیم نوترکیب زایلاناز به ترتیب 1/4 (mg/ml) و 87 (unit/ml) تعیین نمود.
نتیجه‌گیری: زایلانازها مهمترین آنزیم‌های مکمل جیره طیور می‌باشند که در جیره‌های بر پایه گندم اضافه می‌شوند. نتایج نشان داد، آنزیم نوترکیب حاصل، دارای فعالیت و غلظت مناسب می‌باشد و مقاوم به حرارت است. همچنین آنزیم نوترکیب زایلاناز به دلیل خاصیت ترشحی بودن با هزینه اندک قابل استحصال می‌باشد.

کلیدواژه‌ها

عنوان مقاله [English]

Cloning and expression of recombinant xylanase enzyme (xynA) in E. coli.

نویسندگان [English]

  • Amin Sadeghi Alikelayeh 1
  • Neda Mirakhorli 2
  • Mohammad Reza Akbari 3
  • Behzad Shareghi Brojeni 4
1 Department of Biotechnology, Faculty of Agriculture, University of Shahrekord, Chaharmahal and baktyari province, IRAN
2 Assistant Professor, Department of Biotechnology and Plant Breeding, Faculty of Agriculture, Shahrekord University, Shahrekord, Iran
3 Assistant Professor, Department of Animal and Poultry Science, Faculty of Agriculture, Shahrekord University, Shahrekord, Iran
4 Professor, Department of Biochemistry, Faculty of Basic Science, Shahrekord University, Shahrekord, Iran.
چکیده [English]

Objective
Today, global increasing in corn prices has led to the replacement of wheat instead of corn in poultry diets. The NSPs in the cell wall prevents the uptake of wheat nutrients by poultry. Using xylanase is one of the methods to remove NSPs. Xylanases can digest xylan. The aim of current investigation was to produce xylanase (xynA) gene as a supplement of poultry diets in E. coli.
Materials and methods
In present study, the thermostable xylanase (xynA) gene in a bacterial secretory expression system along with: Shine-Dalgarno sequence, Usp45 signal peptide and T7 promoter was cloned in plasmid pET-22b (+) from E. coli strain BL21 (DE3) using The heat shock method. IPTG were used at different times to induce the expression of recombinant xylanase gene. In addition, catalytic indicators were done according to the DNS method.
 
Results
PCR colony confirmed the presence of 743 bp recombinant xylanase gene sequence on 1% agarose gel. SDS-PAGE showed protein with 27 kDa molecular weight. Also, the activity of recombinant protein was 189.47 (unit/ml) using DNS method at optimum temperature of 65 °C and pH=6. As well as, michaelis-menten curve determined Km and Vmax 4.1 (mg/ml) and 87 (unit/ml), respectively.
 
Conclusions
Xylanase are the most important complementary enzymes in poultry diets that are added to wheat-based diets. Results showed that produced recombinant xylanase is thermostable enzyme with acceptable activity and concentration. Furthermore, because of the secretory expression system, it is produced at a lower cost.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Recombinant xylanase enzyme
  • E. coli
  • Wheat

مراجع

محمدی‌فر آمنه، فقیه ایمانی سید علی، محمدآبادی محمد رضا، سفلایی محمد (1392) تأثیر ژن TGFb3 بر ارزش‌های فنوتیپی و ارثی صفات وزن بدن در مرغ بومی استان فارس. مجله بیوتکنولوژی کشاورزی 5(4)، 136-125.
References
Afzal S, Saleem M, Yasmin R et al. (2010) Pre and post cloning characterization of a beta-1, 4-endoglucanase from Bacillus sp. Mol Bio Res 37, 23–1717.
Akyol I, Comlekcioglu U, Kar B et al. (2009) Cloning of a xylanase gene xyn2A from rumen fungus Neocallimastix sp. GMLF2 in Escherichia coli and its partial characterization. Biologia 64, 664–670.
Bhardwaj N, Kumar B, Verma P (2019) A detailed overview of xylanases: an emerging biomolecule for current and future prospective. Bioresour Bioprocess 6, 40. 
Bilgin S, Ulusu Y, Kudug H, Gokce I (2018) Cloning, Expression and Characterization of Xylanase (xyn-akky1) from Bacillus subtilis in Escherichia coli. Sakarya Uni J Sci 22, 1508–1517.
Dhiman SS, Sharma J, Battan B (2008) Industrial applications and future prospects of microbial xylanases. Bio Resource 3, 1377–1402.
Engberg M, Hedemann S, Steenfeldt S, Jensen B (2004) Influence of whole wheat and xylanase on broiler performance and microbial composition and activity in the digestive tract. Poult Sci 83, 925–938.
Fajardo P, Pastrana L, Endez J et al. (2012) Effects of Feeding of Two Potentially Probiotic Preparations from Lactic Acid Bacteria on the Performance and Faecal Microflora of Broiler Chickens. The Sci World J 23, 1–9.
Glickman JF, Schmid A (2007) Farnesyl pyrophosphate synthase: real-time kinetics and inhibition by nitrogen-containing bisphosphonates in a scintillation assay. Assay Drug Dev Technol 5, 205–214.
Hristov AN, Oh J, Lee C et al. (2013) Mitigation of greenhouse gas emissions. In Gerber, PJ, Henderson, B and Makkar, HPS. Eds. Livestock production–a review of technical options for non-CO2 emissions. FAO Anim Prod Health Paper 177. 
Jie H, Li Z, Wang P et al. (2017) A simple method based on Sanger sequencing and MS Word wildcard searching to identify Cas9-induced frameshift mutations. Lab Invest 97, 1500–1507.
Laemmli UK (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227, 680–685.
Laura R, Jarboe AB, Ping LB et al. (2012) Optimization of enzyme parameters for fermentative production of biorenewable fuels and chemicals. Comput Struct Biotechnol J 3, e10005. 
Ma L, Aizhan R, Wang X et al. (2020) Cloning and characterization of low‑temperature adapted GH5‑CBM3 endo‑cellulase from Bacillus subtilis 1AJ3 and their application in the saccharification of switchgrass and coffee grounds. AMB Expr 10, 42.
Mao S, Lu Z, Zhang CH et al. (2013) Purification, characterization, and heterologous expression of a thermostable β-1, 3-1, 4-glucanase from Bacillus altitudinis YC-9. Appl Biochem Biotechnol 169, 960–975.
McCleary BV (2001) Analysis of feed enzymes. In: Enzymes in Farm Animal Nutrition, M.R. Bedford and G.G. Partridge (Eds.). CAB International, 406.
Miller GL (1959) Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugars. Anal Chem 31, 426–428.
Moazeni S, Mohammadabadi MR, Sadeghi M et al. (2016) Association between UCP Gene Polymorphisms and Growth, Brreeding Value of Growth and Reproductive Traits in Mazandaran Indigenous Chicken. Open J Anim Sci 6, 1-8. 
Mohammadifar A, Faghih Imani SA, Mohammadabadi MR, Soflaei M (2014) The effect of TGFb3 gene on phenotypic and breeding values of body weight traits in Fars native fowls. Agric Biotech J 5, 125-136 (In Persian). 
Mohammadifar A, Mohammadabadi MR (2018) Melanocortin-3 receptor (mc3r) gene association with growth and egg production traits in Fars indigenous chicken. Malay Appl Biol 47, 85–90.
Mohammadifar A, Mohammadabadi MR (2017) The Effect of Uncoupling Protein Polymorphisms on Growth, Breeding Value of Growth and Reproductive Traits in the Fars Indigenous Chicken. Iran J Appl Anim Sci 7, 679-685. 
Ndazigaruye G, Kim DH, Kang CH et al. (2019) Effects of Low-Protein Diets and Exogenous Protease on Growth Performance, Carcass Traits, Intestinal Morphology, Cecal Volatile Fatty Acids and Serum Parameters in Broilers. Anim 9, 226.
Osek M, Milczarek A, Janocha A, Świnarska R (2010) Effect of triticale as a partial or complete wheat and maize substitute in broiler chicken diets on growth performance, slaughter value and meat quality. Ann Anim Sci 10, 275–283.
Pastor FIJ, Gallardo O, Sanz-Aparicio J (2007) Xylanases: molecular properties and applications. In: Polaina J, MacCabe AP (eds) Industrial enzymes. Springer, 65–82.
Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T (1989) Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd edn. Cold Spring Laboratory, Cold Spring Harbor, NY.
Vasudevan R, Gale GAR, Schiavon AA et al. (2019) CyanoGate: A modular cloning suite for engineering cyanobacteria based on the plant MoClo syntax. Plant Physiol, 01401.
Vieco-Saiz N, Belguesmia Y, Raspoet R et al. (2019) Benefits and Inputs from Lactic Acid Bacteria and Their Bacteriocins as Alternatives to Antibiotic Growth Promoters During Food-Animal Production. Front Microbiol 11, 10–57.
Wang J, Zhang H, Wu M, Tang C (2011) Cloning and sequence analysis of a novel xylanase gene, Auxyn10A, from Aspergillus usamii. Biotechnol Lett 33, 1029–1038. 
Wang W, Yan-long J, Yi-chun L et al. (2018) Impact of different promoters, promoter mutation, and an enhancer on recombinant protein expression in CHO cells. Sci Report 7, 10416.
Yadav P, Maharjan J, Korpole S et al. (2018) Production, Purification, and Characterization of Thermostable Alkaline Xylanase From Anoxybacillus kamchatkensis NASTPD13. Bioeng Biotechnol 6, 65.
مجله بیوتکنولوژی کشاورزی
دوره 12، شماره 4
بهمن 1399
صفحه 1-21

فایل ها

هم رسانی

ارجاع به این مقاله

آمار