بررسی اثر عصاره الکلی برگ‌ گیاه برگ‌بو بر پروماستیگوت‌های لیشمانیا ماژور از طریق روش رنگ سنجی در مدل برون‌تنی

نوع مقاله : مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 دانش آموخته کارشناسی ارشد دانشکده کشاورزی و منابع طبیعی دانشگاه هرمزگان

2 استادیار بخش بیوتکنولوژی دانشکده کشاورزی دانشگاه شهید باهنر کرمان

3 رئیس مرکز لیشمانیا دانشگاه ّّبزشکی کرمان

چکیده

لیشمانیوز، یکی از بیماری‌های انگلی گسترده در جهان، یک بیماری مشترک بین انسان و دام محسوب می‌گردد که توسط تک یاخته‌ای از جنس لیشمانیا ایجاد می‌شود. داروهای گیاهی در بسیاری از موارد فاقد هر گونه عارضه و از طرفی در دسترس و ارزان می‌باشند. از این رو پیدا کردن یک داروی گیاهی برای درمان لیشمانیوز یکی از اهداف جهانی است. این مطالعه به‌منظور ارزیابی فعالیت ضد لیشمانیایی عصاره الکلی برگ‌های گیاه دارویی برگ‌بو، روی مرحله پروماستیگوت لیشمانیا ماژور با روش رنگ سنجی در شرایط آزمایشگاهی انجام شد.
مواد و روش‌ها: برای تعیین سمیت عصاره بر سلول­های ماکروفاژ از روش MTT و خوانش با الایزا و برای تعیین اثر آنتی پروماستیگوتی عصاره از روش بررسی آپوپتوز با فلوسایتومتری استفاده شد. میزان CC50  و IC50 از طریق نتایج این دو تست محاسبه شدند و در هر دو تست از آمفوتریسین به عنوان کنترل مثبت استفاده شد. برای این منظور، پروماستیگوت‌ها به همراه غلظت‌های مختلف عصاره برگ برگ بو و آمفوتریسین B بر روی پلیت 96 خانه اضافه و به مدت 72 ساعت انکوبه شدند و سپس ارزیابی ها براساس آزمون‌های فوق صورت پذیرفت. داده‌های آماری با استفاده از روش دانکن، ANOVA و نرم افزار SAS در سطح احتمال P≤0/05 آنالیز شدند.
نتایج: بیشترین مقدار آپوپتوز مربوط به تیمار800 میکرو‌گرم بر میلی‌لیتر که به‌ترتیب در آمفوتریسین B 35/97 و عصاره برگ‌بو 04/63 درصد بود. غلظتی از دارو که از رشد 50% سلولها جلوگیری می‌کند (CC50)، برای آمفوتریسین B 6/129 و برای برگ‌بو 5/200  میکروگرم بر میلی‌لیتر بود. میزان IC50 پروماستیگوت در آمفوتریسین و برگ‌بو به‌ترتیب به‌طور میانگین 5/18 و 5/589 میکروگرم بر میلی‌لیتر می‌باشد.
نتیجه‌گیری: عصاره برگ گیاه برگ‌بو با افزایش غلظت از رشد پروماستیگوت‌ها جلوگیری کرده و در بعضی از غلظت‌ها با یکدیگر و با داروی آمفوتریسین B تفاوت معنی‌داری داشتند. بر اساس نتایج فلوسایتومتری، افزایش آپوپتوزیس وابسته به دوز دیده‌شد. با توجه به نتایج IC50 گیاه برگ‌بو، اثر بخشی بالایی نشان داد. لذا مطالعات بیشتری برای ارزیابی تاثیر آن بر روی انگل لیشمانیا در شرایط بالینی بسیار مطلوب است.

کلیدواژه‌ها


عنوان مقاله [English]

The in vitro effect of alcohlic extract of Laurus nobilis leaves on Leishmania major promastigote stage by colorimetric assay

نویسندگان [English]

  • iman nik aeein 1
  • GHolamreza SHarifi sirchi 2
  • Iraj Sharifi 3
1 MSc Student, College of Agriculture and Natural Resources, University of Hormozgan, Bandar Abbas
2 Department of Biotechnology Engineering, Faculty of Agriculture, Shahid Bahonar University of Kerman
3 Leishmaniasis Research Center. Kerman University of Medical Sciences
چکیده [English]

Objective
Leishmaniasis is one of the most prevalent parasitic unicellular diseases worldwide, which is common between human and animal. At present, antiviral compounds such as glucantime and amphotericin B are used to treat cutaneous leishmaniasis. In many cases, herbal remedies do not have any side effects and are both affordable and inexpensive. Therefore, finding a herbal medicine to treat leishmaniasis is one of the global goals. The aim of this study was to evaluate the anti-leishmanial activity of alcoholic extract of leaves of bay laurel (Laurus nobilis) on promastigote stage of Leishmania major by in vitro colorimetric method.
Materials and methods
Different concentrations of leaf extract of bay laurel were studied against L. major promastigotes compared to amphotericin B. L. major promastigotes were cultured in RPMI-1640 medium supplemented with 10 Percent FBS. Optical absorption (OD) was measured by ELISA method to determine 50 Percent inhibitory concentration (IC50) of drugs. Promastigotes were added to the 96-well plate and incubated for 72 h with different concentrations of bay laurel leaf extract and amphotericin B (800, 600, 400, 200, 50, 25 and 10 μg ml-1). Flow cytometry was used to evaluate apoptosis. All concentrations were incubated in MTT assay for 3 min and flow cytometric for 2 h. Statistical data were analyzed by Duncan, ANOVA and SAS software at P≤0.05.
Results
Maximum amount of apoptesis (97.35 Percent) in amphotericin B treatments as positive control was related to treatment 800 μg ml-1 concentration.  In leaf extract treatments of bay laurel, greatest amount of apoptosis (63.04 Percent) was related to treatment of 800 μg ml-1 concentration. CC50 of amphotericin B and leaf extract of bay laurel treatments was obtained in 129.6 and 200.5 μg ml-1 concentrations, respectively. Inhibitory concentration (IC50) of amphotericin B and leaf extract of bay laurel treatments was 18.5 and 589.5 μg ml-1 on L. major promastigotes.
Conclusions
The results were shown increased dose-dependent apoptosis based on flow cytometric.  The results of this study showed that proximity of L. major promastigotes and amphotericin B concentration treatments leads to apoptosis-like cell death, which increases with increasing drug concentration. According to the IC50 results of leaf extract of bay laurel and high its apoptetic efficiency, further studies are needed to evaluate its effective combinants of leaf extract on Leishmania parasite and also, to design clinical setting for this herbal drug.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Amphotericin B
  • Apoptosis
  • Colorimetric method
  • Laurus nobilis
  • Leishmania major
امیدبیگی ر (1390). تولید و فرآوری گیاهان دارویی ( جلد اول). شرکت به نشر (انتشارات آستان قدس رضوی)، 348-20.
بنیادیان م؛ حجازی ح؛ عزیزی ح  و دیگران (1394). اثر ضد لیشمانیایی اسانس گیاه اسطوخودوس علیه لیشمانیا ماژور در شرایط آزمایشگاهی. مجله دانشگاه علوم پزشکی شهر کرد 17، 101-93.
براتی م؛ شریفی ی؛ شریفی‌فر ف (1388). بررسی اثرات ضد لیشمانیایی عصاره‌های آویشن شیرازی، اسپند و مورد با روش رنگ سنجی به صورت برون‌تنی. مجله دانشگاه علوم پزشکی کرمان 17 (1) :41-32.
پدرام نیا ا؛ مرتضوی س؛ نعمت شاهی م (1397). بررسی ترکیبات شیمیایی و اثرات ضدمیکروبی عصاره برگ گیاه برگ‌بو بر روی سویه‌های مختلف میکروبی. علوم و صنایع غذایی 15، 226 – 217.
پور صفوی ز؛  سید طبایی ج؛ خیراندیش ف و دیگران ( 1397). اثر عصاره آبی و هیدرو الکلی برگ زیتون بر آماستیگوت‌های لیشمانیا تروپیکای حساس و مقاوم به گلوکانتیم در شرایط(In Vitro). فصلنامه علمی پژوهشی دانشکده پزشکی دانشگاه علوم پزشکی و خدمات بهداشتی درمانی شهید بهشتی42 ، 51-46.
دشت پیما ع ؛ مشفع ع ؛ منظوری ل و دیگران (1394). اثر بابوبه بر بهبودی زخم لیشمانیوز جلدی ناشی از لیشمانیا ماژور در موش‌های بالب سی، ارمغان دانش، مجله علمی پژوهشی دانشگاه علوم پزشکی یاسوج 20، 13-127.
دلیمی ع؛ اربابی م ؛ ناصری فر ر (1392).  بررسی تاثیر عصاره آبی دو گیاه Artemisia sieberi Besser Scrophularia striata Boiss  بر رشد لیشمانیا ماژور در شرایط In vitro. فصلنامه علمی- پژوهشی تحقیقات گیاهان دارویی و معطر ایران 29  ، 246-237.
سلمانیان ش؛ صادقی ماهونک ع؛ خمیری م؛ ماستری فراهانی م ( 1392). اسیدهای فنولی، فعالیت ضدرادیکالی و ضدمیکروبی عصاره متانولی برگهای اوجی. مجله علوم تغذیه و صنایع غذایی ایران 8، 154 – 145.
شرافتی چالشتری ر؛ شرافتی چالشتری ف؛ شرافتی چالشتری ع؛ اشرفی ک (1388). بررسی اثر ضد میکروبی و تعیین میزان ترکیبات فنولی، فلاونوئیدی و فلاونولی عصاره اتانولی گل میمونی (Scrophularia striata). مجله دانشگاه علوم پزشکی شهرکرد 11، 37 – 32.
شریفی سیرچی غ ر؛ کاظمی‌پور ع (1388). بیوتکنولوژی: اصول و مبانی. دانشگاه شهید باهنر کرمان، 301 – 20.
عظیم زاده ب؛ جهادی م؛ فاضل م (1396). خواص آنتی اکسیدانی و ضد باکتریایی عصاره ی آبی گیاه برگ‌بو در برابر استافیلوکوکوس اورئوس و اشریشیاکولای. بهداشت مواد غذایی 7 ، 74-65.
کاظمی ا؛ طالاری ص ع؛ هوشیار ح (1386). تاثیر عصاره الکلی زرشک بر زخم ناشی از لیشمانیا ماژور در موش BALB/c . مجله دانشکده بهداشت و انستیتو تحقیقات بهداشتی 5 ، 42-35.
نور صباغی ف؛ عابدین‌زاده م؛ جلال‌لو ن (1395). بررسی اثر عصاره الکلی گیاه ترشک (Rumex) بر روی لیشمانیوز پوستی ناشی از لیشمانیا ماژور (Leishmania major) در موش‌های BALB/c. مجله علوم پزشکی رازی23، 35-28.
References
Azimzadeh B; Jahadi M; Fazel M (2017). Antioxidant and antibacterial effects of laurus nobilis aqueous extract again Staphylococcus aureus and Escherichia coli. Journal of Food Hygiene 7, 65 -74 (In Persian).
Barati M; sharifi I; sharififar F (2010). In vitro evaluation of anti-leishmanial activities of zataria multiflora boiss, peganum harmala and myrtus communis by colorimetric assay. Journal of Kerman University of medical sciences 17, 32 - 41 (In Persian).
Bonyadian M; Hejazi H; Azizi H et al. (2015). Antileishmania activity of Levandula officinalis essence against Leishmania major in in vitro media. J Shahrekord Univ Med Sci 17, 93-101 (In Persian).
Bouvier J; Etges R; Bordier C (1987). Identification of the promastigote surface protease in seven species of leishmania. Mol Biochem parasitol 24, 9-73.
Cherrat L; Espina L; Bakkali M et al. (2014). Chemical composition and antioxidant properties of Laurus nobilis L. and Myrtus communis L. essential oils from Morocco and evaluation of their antimicrobial activity acting alone or in combined processes for food preservation. J Sci Food Agric 94, 1197-204.
Croft S L; Seifert K; Yardley V (2006). Current Scenario of drug development for leishmaniasis. Indian J Med Res 123, 399-410.
Dalimi A; Arbabi M; Naserifar R (2013). The effect of aqueous extraction of artemisia sieberi besser and scrophularia striata boiss. On leishmania major under in vitro conditions.   Iranian journal of medicinal and aromatic plants 29, 237-246 (In Persian).
Dashtpeima A; Moshfe A; Manzoori L et al. (2015). The Effect(s) of Matricaria chamomilla on Leishmania major Ulcers in Balb/c Mice. Armaghane danesh 20, 127-137 (In Persian).
Desjeux P (2001). The increase in risk factors for leishmaniasis worldwide. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene 95, 239-243.
Desjeux P (2004). Leishmaniasis: current situation and new perspectives. Comp Immunol Microbiol Infect Dis 27, 305-318.
Fard MD; Kalantari M; Rassi Y; Javadian E (2003). The PCR- based detection of Leishmania major infection in Meriones libycus (Rodentia: Muridae) from southern Iran. An of Trop Med parasite 97,811-816.
Kazemi E; Talari S; Hooshyar H (2007). The effect of an alcoholic extract of Berberis Vulgaris on Cutaneous leishmaniasis (L. major) in BALB/c mice. Sjsph 5, 35-42 (In Persian).
Keskin D; Oskay D; Oskay M (2010). Antimicrobial activity of selected plant spices marketed in the West Anatolia. International journal of agriculture & biology 12, 916–920
Kyriazis J; Aligiannis N; Polychronopoulos P (2013). Leishmanicidal activity assessment of Olive tree extracts. Phytomedicine 20, 275-281.
Lamidi M; DiGiorgio C; Delmas F et al. (2005). In vitro cytotoxic, antileishmanial and antifungal activities of ethnopharmacologically selected Gabonese plants. J Ethnopharmacol 102, 90-185.
Markell EK; Voge M A; John DT (2006). Medical parasitology (7th ed.) W. B. Saunders Company Philadelphia, 148-159.
Minodier P; Parola p (2007). Cutaneous leishmaniasis treatment. Travel Med infect Dis 5, 8-150.
Mishra BB, singh RK, Srivastava A et al. (2009). Fighting against leishmaniasis: search of alkaloids as future true potential anti-Leishmanial agents. Mini reviews in medicinal chemistry 9, 107-23.
Newman Dj; Cragg GM (2016). Natural product as surces of new drugs from 1981 to 2014. J.Nat.Prod 79(3), 629-661.
Nosratabadi SJ; Sharifi I; Sharififar F; Bamorovat M; Daneshvar H; Mirzaie M (2015). In vitro antileishmanial activity of methanolic and aqueous extracts of Eucalyptus camaldulensis against leishmania major. J. Parasit Dis 39, 18-21.
Noursabaghi F; Abedinzade M; Jalallou N (2016). Evaluation the effect of Rumex alcoholic extract against cutaneous leishmaniasis caused by Leishmania major in Balb/c mice. RJMS 23, 28-35 (In Persian).
Omidbeygi R (2011). Production and processing of medicinal plants (volume 1). Astan Quds Razavi. pp. 20-348 (In Persian).
Pedram Nia A; Mortazavi A; Nemat Shahi M (2018). Study of Chemical Compounds and The Antimicrobial Effects of Leaf Extract of Laurus nobilis L on Various Microbial Strains. JFST 81, 217 -226 (In Persian).
Poursafavi Z; Seyyed Tabaei S J; Kheirandish F et al. (2018). Effect of olive leaf aqueous and hydroalcoholic extract on Leishmania tropica Glucantime resistance and sensitivity in vitro. Research in Medicine 42, 46-52 (In Persian).
Salmanian Sh; Sadeghi Mahoonak AR; Khomeiri M; Masteri Farahani MR (2013). Phenolic acid content, antiradical and antimicrobial properties of Mentha aquatic leaf methanolic extract. Iranian Journal of Nutrition Sciences & Food Technology 8, 145 – 154 (In Persian).
Sharafati chaleshtori R; Sharafati chaleshtori F; Sharafati chaleshtori A; Ashrafi K (2009). Antimicrobial effects and evaluation of total phenols, flavonoids and flavonols contents of ethanolic extracts of Scrophularia striata. Journal of Shahrekord University of Medical Sciences 11, 32 – 37 (In Persian).
Sharifi G R; Kazemipour A (2009). Biotechnology: principles. Shahid bahonar university of Kerman publication, 20 – 301 (In Persian)..
World Health Organization (2021). W.H.O. Statistical Information System. Geneva, Switzerland. https://www.who.int/health-topics/leishmaniasis#tab=tab_1.
Williams C; Espinosa O. A; Montenegro H et al. (2003). Hydrosoluble formazan XTT: its application to natural products drug discovery for leishmania. J. Microbiol Methods 55, 6-813.