طراحی و ساخت سازه‌های بیانی نوترکیب به منظور تولید و ترشح پروتئین‌های نوترکیب در ریشه‌های موئین

نوع مقاله : مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 گروه زیست فرآورده‌های گیاهی، پژوهشکده زیست فناوری کشاورزی، پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست فناوری، تهران، ایران.

2 پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست فناوری، پژوهشکده زیست فناوری کشاورزی، گروه زیت فراورده های گیاهی تهران کیلومتر 15 اتوبان کرج-

چکیده

هدف: استفاده از سیستم‌های بیانی گیاهی برای تولید پروتئین‌های نوترکیب دارای مزایایی از جمله وجود روش‌های متفاوت تراریختی و کشت، وقوع تغییرات مناسب پس از ترجمه و عدم خطر آلودگی با عوامل بیماری‌زای حیوانی و میکروبی می‌باشد. با این‌حال میزان کم تولید محصول در این سیستم‌های بیانی، همواره به عنوان چالشی عمده مطرح است. سیستم‌های بیانی مبتنی بر ترشح در کشت ریشه‌های موئین، می‌توانند راه‌کار مناسبی برای تولید پیوسته‌ مواد موثره بدون نیاز به تخریب بافت گیاهی باشند و به نوبه‌ خود، موجب سهولت فرآیند خالص‌سازی و کاهش قابل توجه هزینه‌های مربوط به آن ‌شوند. این پژوهش با هدف طراحی و ساخت سازه‌هایی با تلفیق همزمان پیشبر اختصاصی ریشه NtREL1 با سه ترادف نشانه پاتاتین، پکتین متیل استراز و کالرتیکولین برای افزایش بیان اختصاصی پروتئین‌های نوترکیب در کشت ریشه‌های موئین و در ادامه ترشح آنها به درون محیط کشت مایع به انجام رسید.
مواد و روش‌ها: توالی نوکلئوتیدی پیشبر اختصاصی ریشه‌ای NtREL1 و پپتیدهای نشانه پاتاتین، پکتین متیل استراز و کالرتیکولین از پایگاه داده NCBI دریافت گردید. توالی این پیشبر به منظور شناسایی عناصر تنظیمی Cis دخیل در بیان اختصاصی ریشه‌ای توسط نرم افزارهای PLACE و PLANT CARE مورد بررسی قرار گرفت. مطالعات بیوانفورماتیکی به منظور طراحی سازه‌های بیانی pBI121 واجد توالی نوکلئوتیدی پیشبر در ترکیب با پپتیدهای نشانه به انجام رسید و جایگاه‌های برشی مناسب در دو سر قطعات مورد نظر طراحی گردید. پس از دریافت قطعات سنتزی در ناقل pUC57، قطعات با واکنش هضم آنزیمی جداسازی شده و در سازه بیانی pBI121 همسانه‌‌سازی شدند.
نتایج: بررسی پیشبر NtREL1 نشان داد این پیشبر، غنی از نوکلئوتیدهای AT است. این توالی‌ها به دلیل سهولت در تبدیل از شکل دو رشته‌ای به تک رشته‌ای،  موجب بهبود فرآیند شناسایی توسط سیستم‌های رونویسی و  افزایش بیان ژن‌ها می شوند. صحت همسانه‌سازی پیشبر NtREL1 در ترکیب با سه پپتید نشانه پاتاتین، پکتین متیل استراز و کالرتیکولین در سازه بیانی pBI121 با استفاده از واکنش کلونی پی‌سی‌آر، هضم آنزیمی و توالی‌یابی قطعات همسانه‌سازی شده در سازه بیانی pBI121 با استفاده از آغازگرهای اختصاصی، تائید شد.
نتیجه‌گیری: از آنجایی که ناقل‌های بیانی مبتنی بر pBI121 نسبت به سایر ناقل‌های بیانی، کارایی بالایی داشته و به طور گسترده در پروژه‌های تراریزش ژنتیکی و بیان پروتئین‌های نوترکیب در گیاهان مورد استفاده قرار می‌گیرند، ناقل‌های نوترکیب ساخته شده در این پژوهش می‌توانند به نحوی موثر برای تولید و ترشح پروتئین‌های نوترکیب در سیستم‌های بیانی، مانند کشت ریشه‌های موئین مورد استفاده قرار گیرند.

کلیدواژه‌ها


عنوان مقاله [English]

Designing and constructing recombinant expression cassettes for production and secretion of recombinant proteins in the hairy root

نویسندگان [English]

  • Shaghayegh Afraz 1
  • Atena Mozafari 1
  • Ali Hatef Salmanian 2
1 Plant Bioproducts Department, National Institute of Genetic Engineering and Biotechnology, Tehran, Iran.
2 National Institute for Genetic Engineering and Biotechnology (NIGEB), Tehran POBox: 14965/161
چکیده [English]

Objective
The use of plant expression systems to produce recombinant proteins have advantages such as different methods for transformation and culture, occurrence of appropriate post-translational modifications and no risk of contamination with animal and microbial pathogens. However, low productivity in these expression systems have always been a major challenge. Secretion-based expression systems, such as Hairy Root Cultures (HRCs), is a convenient way to continuously produce active ingredients without the need for plant tissue degradation, which will facilitate the purification process and significantly reduce related costs. This study aimed to designing and constructing vectors carrying NtREL1 root specific promoter in combination with patatin, pectin methyl esterase and calreticulin signal peptides at the same time in order to increase the specific expression of recombinant proteins in hairy root culture and their subsequent secretion into hydroponic medium.
  
Materials and methods
The nucleotide sequence of NtREL1 root specific promoter, patatin, pectin methyl esterase and calreticulin signal peptides were retrieved from NCBI database. To identify cis acting regulatory elements involved in specific expression, the NtREL1 sequence was investigated by PLACE and PLANT CARE softwares. Bioinformatics studies were performed to design pBI121 expression vector with NtREL1 promoter in combination with signal peptides and appropriate restriction sites. After receiving the synthetic fragments in pUC57 vector, the fragments were digested by restriction endonuclease and sub cloned in pBI121 expression vector. 
 
Results
Examination of the NtREL1 promoter showed that this promoter is rich in AT nucleotides. These sequences can improve the recognition process by transcription systems and increase gene expression due to their ease of conversion from double-stranded to single-stranded form. The accuracy of NtREL1 promoter sub cloning upstream of patatin, pectin methyl esterase and calreticulin signal peptides in pBI121 expression vector were confirmed using colony PCR, digestion reactions and sequencing.
 
Conclusions
Since pBI121-based expression vectors are more efficient than other expression vectors and widely used in genetic transformation and expression of recombinant proteins in plants, this recombinant vectors can be applied effectively for recombinant protein production and its secretion in expression systems like hairy root culture.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Expression vector
  • Root specific promoter
  • Signal peptide
مظفری آتنا، کاظمی روح الله، امانی جعفر و همکاران (1394) ارزیابی گیاه تراریخت کلزای بیان کننده پروتئین نوترکیب از زیر واحد    B  سم‌هایSTX2  و CTX باکتریهای اشریشیا کلای و ویبریوکلرا. مجله زیست فناوری گیاهان زراعی 5(11)، 13-1.
 
References
Aleinein R, Schäfer H, Wink M (2015) Rhizosecretion of the recombinant antimicrobial peptide ranalexin from transgenic tobacco hairy roots. RRJBS Phytopathol Gene Diseas 1, 45-55.
Amani J, mousavi SL, Rafati S, Salmanian AH (2011) Immunogenicity of a plant-derived edible chimeric espa, intimin and tir of escherichia coli o157: h7 in mice. Plant Sci 180, 620-627.
Benfey PN, Chua NH (1990) The cauliflower mosaic virus 35s promoter: combinatorial regulation of transcription in plants. Science 250, 959-966.
Carneiro NP, Carneiro AA (2011) Maize transformation to obtain plants tolerant to viruses by RNAi technology. InTech.
Drake PM, Barbi T, Sexton A et al. (2009) Development of rhizosecretion as a production system for recombinant proteins from hydroponic cultivated tobacco. FASEB J 23, 3581-3589.
Fehlberg V, Vieweg MF, Dohmann EM et al. (2005) The promoter of the leghaemoglobin gene vflb29: functional analysis and identification of modules necessary for its activation in the infected cells of root nodules and in the arbuscule-containing cells of mycorrhizal roots. J Exp Bot 56, 799-806.
Ganapathy M (2016) Plants as bioreactors-a review. Adv Tech Biol Med 4, 2379-1764.1000161.
Gerasimova S, Smirnova O, Kochetov A, Shumnyi V (2016) Production of recombinant proteins in plant cells. Russ J Plant Physiol 63, 26-37.
Grace ML, Chandrasekharan MB, Hall TC, Crowe AJ (2004) Sequence and spacing of tata box elements are critical for accurate initiation from the β-phaseolin promoter. J Biol Chem 279, 8102-8110.
Gurusamy PD, schäfer H, Ramamoorthy S, Wink M (2017) Biologically active recombinant    human erythropoietin expressed in hairy root cultures and regenerated plantlets of Nicotiana Tabacum L. PLoS One 12, e0182367.
Häkkinen ST, Raven N, Henquet M et al. (2014) Molecular farming in tobacco hairy roots by triggering the secretion of a pharmaceutical antibody. Biotechnol Bioeng 111, 336-346.
Hertig C, Rebmann G, Bull J et al. (1991) Sequence and tissue-specific expression of a putative peroxidase gene from wheat (Triticum aestivum L.). Plant Mol Biol 16, 171-174
Huet Y, Ekouna, JPE, Caron A et al. (2014) Production and secretion of a heterologous protein by turnip hairy roots with superiority over tobacco hairy roots. Biotechnol Lett 36, 181-190.
Kamiya N, Nagasaki H, Morikami A et al. (2003) Isolation and characterization of a rice wuschel‐type homeobox gene that is specifically expressed in the central cells of a quiescent center in the root apical meristem. Plant J 35, 429-441
Kim NS, Yu HY, Chung ND et al (2011) Production of functional recombinant bovine trypsin in transgenic rice cell suspension cultures. Protein Expr Purif 76, 121-126.
Kozak M (1989) The scanning model for translation: an update. J Cell Biol 108, 229-241.
Kozak M (1991) Structural features in eukaryotic mrnas that modulate the initiation of translation. J Biol Chem 266, 19867-19870.
Ñopo L, Woffenden BJ, Reed DG et al. (2012) Super promoter: tev, a powerful gene expression system for tobacco hairy roots. Recombinant Gene Expression 501-526.
Mozafari A, Kazemi R, Amani J et al. (2015) Molecular analysis of transgenic canola plant containing chimeric B subunit of bacterial toxin STX2 and CTX from Escherichia coli and Vibrio cholera. Crop Biotechnol J 5, 1-13 (in Persian).
Peng C, Shi C, Cao X et al. (2019) Factors influencing recombinant protein secretion efficiency in Gram-positive bacteria: signal peptide and beyond. Front Bioeng Biotechnol 139.
Pham NB, Schäfer H, Wink M (2012) Production and secretion of recombinant thaumatin in tobacco hairy root cultures. Biotechnol J 7, 537-545.
Schillberg S, Raven N, Spiegel H et al. (2019) Critical analysis of the commercial potential of plants for the production of recombinant proteins. Front Plant Sci 10.
Shirsat A, Wilford N, Croy R, Boulter D (1989) Sequences responsible for the tissue specific promoter activity of a pea legumin gene in tobacco. Mol Gen Genet 215, 326-331.
Stougaard J, Jørgensen JE, Christensen T et al. (1990) Interdependence and nodule specificity of cis-acting regulatory elements in the soybean leghemoglobin lbc 3 and n23 gene promoters. Mol Gen Genet 220, 353-360.
Varasteh-Shams M, Nazarian-Firouzabadi F, Ismaili A (2020) The direct and indirect transformation methods on expressing a recombinant dermaseptin peptide in tobacco transgenic hairy root clones. Curr Plant Biol 24, 100177.
Wilkinson B, Gilbert HF (2004) Protein disulfide isomerase. Biochim Biophys Acta Proteins Proteom 1699, 35-44.
Zhang C, Pan S, Chen H et al (2016) Characterization of NtREL1, a novel root-specific gene from tobacco, and upstream promoter activity analysis in homologous and heterologous hosts. Plant Cell Rep 35, 757-769.