امکان سنجی پالایش ژنتیکی صفت دوقلوزایی در گوسفندان با هدف کاهش تقلبات احتمالی- یک مطالعه‌ی استانی

نوع مقاله : مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 گروه علوم دامی دانشگاه تبریز

2 گروه علوم دامی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه تبریز.

3 استادیار، گروه علوم دامی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه تبریز، تبریز، ایران

4 استاد، گروه علوم دامی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه تبریز، تبریز، ایران

چکیده

هدف: اخیراً، در استان آذربایجان شرقی، حین خرید و فروش قوچ متعلق به نژاد گوسفندان برتر حامل ژن باروری، شماری از شکایات دامداران در خصوص عدم تطبیق ادعای فروشنده با عملکرد میش در مزرعه مشاهده شده است. با این انگیزه‌ی تحقیقاتی، هدف از پژوهش حاضر در گام اول، تلفیق دو تکنیک PCR-RFLP و PCR-Sequencing و متعاقب آن، برای پالایش ژنتیکی جایگاه ژنی FecB مرتبط با صفت چندقلوزایی در گوسفندان نژاد بورولا- افشاری و گوسفندان دورگ قزل-رومانوف می‌باشد و در گام دوم و اصلی، اقدام به بررسی ریسک عدم صداقت احتمالی و همچنین امکان‌سنجی شناسایی تقلبات احتمالی، حین داد و ستد دام در سطح استان آذربایجان شرقی می باشد.
مواد و روش‌ها: در پژوهش حاضر، نمونه‌های خون از مجموع تعداد 62 رأس میش و قوچ نژاد بورولا- افشاری از واحدهای گوسفندداری اطراف تبریز و 30 رأس میش دورگ قزل- رومانوف اخذ گردید. سپس، در یک گام دو مرحله‌ای مجزا، بعد از تکثیر ناحیه‌ای 190 جفت بازی از ژن BMPR1B توسط واکنش زنجیره‌ای پلی‌مراز، دو روش مولکولی PCR-RFLP و توالی‌یابی مستقیم سانگر،  بر اساس دستورالعمل آزمایشگاهی روتین، انجام و نتایج ژنوتیپ ثبت گردید و متعاقباً، با استفاده از نرم افزارهای مختلف همچون پاپ ژن و FinchTV و MAFFT به ترتیب، فراوانی ژنوتیپی و اللی و همردیفی توالی‌های مورد تکثیر برای تایید مجدد جهش انجام شد.
نتایج: در انجام بخش مولکولی این تحقیق با استفاده از آغازگرهای پیشنهاد شده (Wilson et al. 2001)، ناحیه‌ی اگزون شماره‌ی 8 ژن BMPR1B که یک قطعه‌ی 190 جفت بازی است به وسیله‌ی PCR تکثیر شد. سپس با استفاده از آنزیم اندونوکلئاز AvaII که آنزیم برشی برای جایگاه FecB بوده و دارای جایگاه شناسایی و برش (G/GWCC) می‌باشد، قطعات تکثیر شده توسط PCR، مورد هضم آنزیمی قرار گرفتند. جایگاه ذکر شده در گوسفندان حامل جهش، باعث برش قطعه‌ی 190 جفت بازی به دو قطعه‌ی30 و 160 جفت بازی می‏گردد. در صورتی که در گوسفندان دارای ژنوتیپ وحشی، آنزیم قادر به شناسایی و برش این جایگاه نیست. در این مطالعه، در مجموع، از 62 رأس گوسفند بورولا- افشاری، 11 رأس دارای ژنوتیپ هموزیگوت برای جهش FecB بودند یعنی دارای دو نسخه از جهش بودند و 51 رأس دارای ژنوتیپ هتروزیگوت بوده و فقط یک نسخه از جهش را دارا بودند. در تمامی 30 رأس گوسفند دورگ قزل-رومانوف نیز هیچ جهشی مشاهده نشد. این نتایج با انجام فناوری توالی‌یابی سانگر در کنار روش PCR-RFLP تایید شد و انجام همزمان دو روش، باعث افزایش صحت و دقت نتایج تحقیق شد.
نتیجه‌گیری: نتایج تحقیق حاضر، نشان داد که یکی از علل عدم تطبیق ژنوتیپ پیش اظهار شده فروشندگان با ژنوتیپ واقعی، خطای قرائت ژنوتیپ و یا تقلبات و ادعای کذب فروشنده می‌تواند باشد. همچنین، تلفیق و کاربری همزمان دو تکنیک مولکولی PCR-RFLP و توالی‌یابی مستقیم می‌تواند خطای فنی ناشی از ژنوتیپ را تا حد امکان به حداقل خود برساند. علاوه بر این، با اعمال تکرارپذیری بالای مشاهدات، متاسفانه وجود 06/8 درصد ( 5 از 62 حیوان) عدم صداقت و ناسازگاری در ژنوتیپ جایگاه ژنی FecB، به اثبات رسید. ایجاد مراکز پالایش و تعیین ژنوتیپ وابسته به دولت در خصوص تشخیص تقلبات، می تواند به نهادهای نظارتی در خصوص خدمات تعیین ژنوتیپ گوسفندان حاوی ژن باروری کمک کند و این، خود به خود آمار تقلبات را کاهش خواهد داد.

کلیدواژه‌ها


عنوان مقاله [English]

Feasibility study of genetic refinement of litter size in sheep with the aim of reducing possible fraud - A provincial study

نویسندگان [English]

  • Mehdi Derakhshan 1
  • Karim Hasanpur 2
  • Arash Javanmard 3
  • Jalil Shodja 4
1 Department of Animal Sciences, University of Tabriz,
2 Department of Animal Science, Faculty of Agriculture, University of Tabriz.
3 Assistant Professor, Department of Animal Sciences, Faculty of Agriculture, University of Tabriz, Tabriz, Iran
4 Professor, Department of Animal Sciences, Faculty of Agriculture, University of Tabriz, Tabriz, Iran
چکیده [English]

Objective
Recently, in East Azerbaijan province, while marketing of top sheep carrying fertility genes became suspected, because a number of farmers complained about the claim of the seller due to the low performance of such ewes on the farm. With this research motivation, the aim of the present study in the first step is to combine PCR-RFLP and subsequent PCR-Sequencing methods for genetic refinement of the FecB gene locus associated with litter size in the Booroola-Afshari sheep breed.
Materials and methods
In this study, overall 62 ewes and rams of Booroola-Afshari sheep and 30 ewes of Ghezel- Romanov hybrids were obtained from different sheep farms around Tabriz. Then, two- separate phase were designed, after amplification of the 190 bp region of the BMPR15 gene by PCR, two molecular PCR- RFLP methods and direct sequencing were performed according to routine laboratory instructions. Genotype results were recorded and subsequently, using different software such as POPGENE, FinchTV and MAFFT, the genotypic, allelic, and alignment frequencies of the amplified sequences were performed to confirm the mutation, respectively.
Results
The results of the present report demonstrated that the source of discrepancy between the identified genotype and the actual genotype can be due to the error of reading the genotype or the seller's fraud and false claim. Also, the combination and both outputs of both molecular techniques, PCR- RFLP and direct sequencing, can minimize the technical error caused by the genotype. In addition, high reproducibility observations confirmed the presence of 8/06% fraud in the FecB gene locus genotype.
Conclusions
The combination of two molecular methods, PCR- RFLP and PCR-sequencing direct sequencing to detect FecB mutations, has shown acceptable efficiencies, and the establishment of government-affiliated genotyping centers for fraud detection can assist regulators in genotyping sheep with fertility genes and moreover may reduce the number of frauds.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Twinning gene
  • Fraud
  • Genotype
  • Molecular test
  • FecB gene
محمدآبادی محمدرضا، کرد محبوبه، نظری محمود (1397) مطالعه بیان ژن لپتین در بافت‌های مختلف گوسفند کرمانی با استفاده از  Real Time PCR. مجله بیوتکنولوژی کشاورزی 10(3)، 123-111.
References
Ahsani MR, Bafti MS, Esmailizadeh AK, Mohammadabadi MR (2011) Genotyping of isolates of Clostridium perfringens from vaccinated and unvaccinated sheep. Small Rumin Res 95, 65-69.
Amiri Roudbar M, Mohammadabadi MR, Mehrgardi AA, Abdollahi-Arpanahi A (2017) Estimates of variance components due to parent-of-origin effects for body weight in Iran-Black sheep. Small Rum Res 149, 1-5
Amiri Roudbar M, Abdollahi-Arpanahi R, Ayatollahi Mehrgardi A et al. (2018) Estimation of the variance due to parent-of-origin effects for productive and reproductive traits in Lori-Bakhtiari sheep. Small Rumin Res 160, 95-102.
Asadpour R, Alijani S, Mahmodi H (2012) Detection of polymorphism in booroola gene (FecB) and its association with litter size in zel sheep breed in Iran. Slovak J Anim Sci 2012(2), 63–66.
Chan PK, Chan DP, To KF et al. (2001) Evaluation of extraction methods from paraffin wax embedded tissues for PCR amplification of human and viral DNA. J Clin Pathol 54(5), 401–403.
Dash S, Maity A, Bisoi PC et al. (2017) Coexistence of polymorphism in fecundity genes BMPR1B and GDF9 of Indian Kendrapada sheep. Explor Anim Med Res 7(7), 33–38.
Davis GH, Balakrishnan L, Ross IK et al. (2006) Investigation of the Booroola (FecB) and Inverdale (FecXI) mutations in 21 prolific breeds and strains of sheep sampled in 13 countries. Anim Reprod Sci 92(1–2), 87–96.
Eghbalsaied S, Amini HR, Rashidi F et al. (2016) Detection of new mutations in exon 8 of BMPR1B gene in Iranian Lori-Bakhtyari, Shal, Ghezel and Afshari sheep breeds. Biocatal Agric Biotechnol 8(3), 1–14.
Ekiz B, Ozcan M, Yilmaz A, Ceyhan A (2005) Estimates of phenotypic and genetic parameters for ewe productivity traits of Turkish Merino (Karacabey Merino) sheep. Turkish J Vet Anim Sci 29, 557-564.
El-Hanafy AA, El-Saadani MA (2009) Fingerprinting of FecB gene in five Egyptian sheep breeds. Biotechnol. Anim Husb 25(4), 205–212.
Esmailizadeh A, Dayani O, Sattaei Mokhtari M (2009) Lambing season and fertility of fat-tailed ewes under an extensive production system are associated with liveweight and body condition around mating. Anim. Reprod Sci 49, e9064.
Fogarty NM (2009) A review of the effects of the Booroola gene (FecB) on sheep production. Small Rumin Res 85, 75-84.
Ghaffari M, Nejati Javaremi A, Rahimi Mianji G (2009) Lack of polymorphism in the oocyte derived growth factor (GDF9) gene in the Shal breed of sheep. South Afr J Anim Sci 39, 335-360.
Ghotbaldini H, Mohammadabadi MR, Nezamabadi-pour H et al. (2019) Predicting breeding value of body weight at 6-month age using Artificial Neural Networks in Kermani sheep breed. Acta Scientiarum. Anim Sci 41, e45282.
Hospital F, Chevalet C, Mulsant P (1992) Using markers in gene introgression breeding programs. Genetics 132, 1199-1210.
Karamiyanfili M (2014) Study genetic trend of growth and reproductive traits of afshari sheep of zanjan university. MS Thesis. University of Zanjan, Zanjan, Iran.
Kolte AP, Mishra AK, Kumar S et al. (2005) A study on effect of carrying FecB gene on body weight in Garole and Garole× Malpura sheep. Asian-Aust J Anim Sci 18(10), 1379–1382.
Koudande OD, Iraqi F, Thompson PC et al. (2000) Strategies to optimize marker assisted introgression of multiple QTL. Mamm Genome 11, 145-150.
Latifi M, Rashidi A, Abdolahi Arpanahi R, Razmkabir M (2019) Comparison of introgression and synthetic breed strategies for litter size trait in sheep using computer simulation. Anim Prod Res 10, 112-119.
Latifi M, Rashidi A, Abdolahi Arpanahi R, Razmkabir M (2018) Assessment of classical and genomic selection methods for introgression a major gene in sheep using simulation. Anim Sci J 124, 171-182.
Mahdavi M, Nanekarani S, Hosseini SD (2014) Mutation in BMPR-IB gene is associated with litter size in Iranian Kalehkoohi sheep. Anim Reprod Sci 147(3–4), 93–98.
Masoudzadeh SH, Mohammadabadi M, Khezri A et al. (2020a) Effects of diets with different levels of fennel (Foeniculum vulgare) seed powder on DLK1 gene expression in brain, adipose tissue, femur muscle and rumen of Kermani lambs. Small Rumin Res 193, e106276.
Masoudzadeh SH, Mohammadabadi MR, Khezri A et al. (2020b) Dlk1 Gene Expression in Different Tissues of Lamb. Iran J Appl Anim Sci 10 (4), 669-677.
Mirzamohammadi E, Rashidi A, Vatankhah M, Jafari M (2014) Evaluation of inbreeding effects on pre -weaning growth traits and lamb survival in Iran-Black sheep. Anim Sci J 101, 62-70.
Mohammadabadi M, Bordbar F, Jensen J et al. (2021) Key genes regulating skeletal muscle development and growth in farm animals. Animals 11 (3), e8.35.
Mohammadabadi MR (2016) Inter-Simple Sequence Repeat Loci associations with predicted breeding values of body weight in Kermani sheep. Genet 3rd Millennium 14, 4383-4390.
Mohammadabadi MR, Esfandyarpoor E, Mousapour A (2017) Using Inter Simple Sequence Repeat Multi-Loci Markers for Studying Genetic Diversity in Kermani Sheep. J Res Develop 5 (2), e154.
Mohammadabadi MR, Kord M, Nazari M (2018) Studying expression of leptin gene in different tissues of Kermani Sheep using Real Time PCR. Agric Biotechnol J 10 (3), 111-122 (In Persian).
Mohammadifar A, Mohammadabadi MR (2011) Application of Microsatellite Markers for a Study of Kermani Sheep Genome. Iran J Anim Sci 42 (4), 337-344.
Moradband F, Rahimi G, Gholizadeh M (2011) Association of polymorphisms in fecundity genes of GDF9, BMP15 and BMP15-1B with litter size in iranian Baluchi sheep. In Asian-australas. J Anim Sci 24(9), 1179–1183.
Oraon T, Singh DK, Ghosh M et al. (2016) Allelic and genotypic frequencies in polymorphic Booroola fecundity gene and their association with multiple birth and postnatal growth in Chhotanagpuri sheep. Vet World 9(11), 1294–1299.
Osman AH (1987) Small Ruminants Research and Development in the Near East, FAO, Animal Production 111th, Paper 55, 39-52.
Petrovic MP, Petrovic VC, Ilic ZZ et al. (2013) Features of the new breed of sheep in Serbia called miss sheep. Reproductive characteristics and body development. J Zoo Wildl Med 64, 70-75.
Potki P, Mirhoseini SZ, Afraz F, Vahidi SMF (2020) A Profile of Single Nucleotide Polymorphisms in Fecundity Genes among Iranian Sheep Breeds by Using Polymerase Chain Reaction–Restriction Fragment Length Polymorphism (PCR-RFLP) Method. Iran J Appl Anim Sci 10(2), 265–285.
Qanbarii S, Osfoori R, Eskandari nasab MP (2009) Introgression of FecB Major Gene into Elite Breeding Flock of Afshari Sheep: Preliminary Evaluation of Polymorphism Content and Applicability of Marker Data. Iran J Appl Anim Sci 39(1), 20-31.
Sepehri R (2016) Identification of nucleotide polymorphism of some genes associated with fat and their relationship with traits carcasses in Afshari lambs and Brolaramino crossbreds using the Bayesian Method. Ph D. Thesis. University of Tabriz, Tabriz, Iran.
Shafieiyan Z, Mohammadi G, Jolodarzadeh A et al. (2013) No mutations of FecB and FecG H in Iranian Lory sheep. Vet Res Forum 4(4), 34-43.
Shahsavari M, Mohammadabadi M, Khezri A et al. (2021) Correlation between insulin-like growth factor 1 gene expression and fennel (Foeniculum vulgare) seed powder consumption in muscle of sheep. Anim Biotechnol 33, 1-11.
Souza C, MacDougall C, Campbell B et al. (2001)   The Booroola (FecB) phenotype is associated with a mutation in the bone morphogenetic receptor type 1 B (BMPR1B) gene. J Endocrinol 169(2), R1-R6.
Taherkhani L (2016) The Study of Booroola Gene Polymorphism in Zandi Breed Sheep by PCR-RFLP. Iran J Appl Anim Sci (19), 12-31.
Tavakolian J (2000) An Introduction to Genetic Resources of Native Farm Animals in Iran. Animal Science Genetic Research Institute Press, Tehran, Iran.
Valipour-Koutanaee O, Farhadi A, Hafezian SH, Gholizadeh M (2019) Molecular and bioinformatics analysis of allelic diversity in IGFBP2 gene promoter in indigenous Makuee and Lori-Bakhtiari sheep breeds. Iran J Appl Anim Sci 9, 283-289.
Wan Somarny W, Roziatul Erin A, Suhaimi A et al. (2013) A study of major prolificacy genes in Malin and Dorper sheep in Malaysia (Kajian gen kebiakan utama pada biri-biri Malin dan Dorper di Malaysia). J Trop Agric 41(2), 85-99.
Wilson T, Wu XY, Juengel JL et al. (2001) Highly prolific Booroola sheep have a mutation in the intracellular kinase domain of bone morphogenetic protein IB receptor (ALK-6) that is expressed in both oocytes and granulosa cells. Biol Reprod 64(4), 1225-1235.‏
Zamani P, Nadri S, Saffaripour R et al. (2015) A new mutation in exon 2 of the bone morphogenetic protein 15 gene is associated with increase in prolificacy of Mehraban and Lori sheep. Trop Anim Health Prod 47(5), 855–860.