بررسی و مقایسه خصوصیات بیوشیمیایی، ساختار مولکولی و روند تکامل ژنتیکی دو آیزوفرم تیوردوکسین نوع h از گیاه انگور عسکری (Vitis vinifera L. cv. Askari)

رضا حیدری جاپلقی¹، رحیم حداد*²، قاسمعلی گروسی²

¹ کارشناس ارشد گروه بیوتکنولوژی کشاورزی، دانشکده فنی و مهندسی، دانشگاه بین­المللی امام خمینی (ره) قزوین

² عضو هیأت علمی گروه بیوتکنولوژی کشاورزی، دانشکده فنی و مهندسی، دانشگاه بین­المللی امام خمینی (ره) قزوین

چکیده

تیوردوکسین­ها (Trxs) پروتئین­هایی کوچک و مقاوم در برابر حرارت هستند که در واکنش­های تبادلی دی­تیول/دی­سولفید شرکت می­کنند. در مقایسه با سایر موجودات زنده، گیاهان حاوی شش نوع تیوردوکسین مختلف شامل f، h، m، o، x و y می­باشند که تیوردوکسین نوع h با داشتن اشکال چندگانه، در فرآیندهای مختلفی همچون محافظت سلول در برابر تنش اکسیداتیو و تنش­های زنده و غیرزنده دخالت دارد. دو ژن تیوردوکسین نوع h، تحت عناوین VvTrxh4 و VvCxxS2، از بافت حبه گیاه انگور عسکری (Vitis vinifera L. cv. Askari) با استفاده از روش واکنش زنجیره­ای پلی­مراز با نسخه­برداری معکوس (RT-PCR) جداسازی و در ناقل پلاسمیدی pUC19 همسانه­سازی شده و خصوصیات بیوشیمیایی، ساختار مولکولی و روند تکامل ژنتیکی آن­ها مورد بررسی و مقایسه قرار گرفت. بررسی توالی نوکلئوتیدی نشان داد که چارچوب خواندنی ژن­های همسانه­سازی شده VvTrxh4 و VvCxxS2 به ترتیب  bp345 و bp 381 طول داشته و پروتئین­هایی با 114 و 126 اسیدآمینه را کد می­کنند. بررسی توالی پروتئینی نشان داد که ژن VvTrxh4 دارای جایگاه فعال معمول WCGPC بوده، در حالی که جایگاه فعال ژن VvCxxS2 به صورت غیرمعمول و به شکل WCIPS می­باشد. وزن مولکولی محاسبه شده و نقطه آیزوالکتریک پیش­بینی شده پروتئین VvTrxh4 به ترتیب برابر 76/12 کیلودالتون و 22/5 و پروتئین VvCxxS2 به ترتیب برابر 25/14 کیلودالتون و 68/4 می­باشد. بررسی­های ساختاری نشان داد که پروتئین­های بدست آمده از نظر ساختار سه­بعدی مشابه می­باشند. در حالی که بررسی­های فیلوژنتیکی ژن­های همسانه­سازی شده با تیوردوکسین­های سایر گیاهان نشان داد که این ژن­ها متعلق به زیرگروه­های متفاوت می­باشند. در این تحقیق ژن VvTrxh4 متعلق به کلاس A از زیرگروه I بوده، اما ژن VvCxxS2 به کلاس B از زیرگروه III تیوردوکسین­های نوع h تعلق دارد.

واژه­های کلیدی: انگور، خصوصیات بیوشیمیایی، تکامل ژنتیکی، تیوردوکسین، همسانه­سازی.

مقدمه

تیوردوکسین­ها (Trxs) پروتئین­هایی کوچک و مقاوم در برابر حرارت هستند که به فراوانی در تمامی موجودات زنده از تک­سلولی­ها تا پرسلولی­های عالی یافت شده (Gelhaye et al., 2004) و به همراه دامنه وسیعی از پیش­ماده­ها، در واکنش­های تبادلی دی­تیول/دی­سولفید شرکت می­کنند (Joudrier et al., 2005). در بین موجودات زنده، پستانداران و تک­سلولی­ها دارای یک یا چند ژن کدکننده تیوردوکسین می­باشند، در حالی که پروژه­های توالی­یابی ژنوم نشان می­دهند که گیاهان دارای انواع مختلفی از ژن­های کدکننده تیوردوکسین­ها می­باشند (Gelhaye et al., 2004 Meyer et al., 2005; Oliveira et al., 2010;). در گیاهان عالی، بر اساس تجزیه و تحلیل ساختار اولیه پروتئینی و موقعیت درون سلولی، تیوردوکسین­ها به شش نوع اصلی تقسیم­بندی می­شوند که عبارتند از: تیوردوکسین­های f، h، m، o، x و y. تیوردوکسین­های f،m ،x  و y درون کلروپلاست­ها قرار داشته (Hall et al., 2010) و تیوردوکسین o متعلق به میتوکندری­ها می­باشد (Laloi et al., 2001). شکل 1 مسیرهای مختلف احیاء تیوردوکسین­ها را در اندامک­های کلروپلاست، میتوکندری و نیز سیتوزول نشان می­دهد. تیوردوکسین­های نوع h درون سیتوزول، میتوکندری، شبکه آندوپلاسمی و حتی هسته سلول قرار داشته و به سه زیرگروه مختلف I، II و III تقسیم­بندی می­شوند (Gelhaye et al., 2005). احیاء تیوردوکسین­های زیرگروه I و II وابسته به مولکول NADPH و با دخالت آنزیم NTR انجام می­شود (Gelhaye et al., 2004)، اما تیوردوکسین­های نوع h زیرگروه III، که اولین بار در درخت صنوبر(Populus spp.)  گزارش شدند (Gelhaye et al., 2003)، از طریق سیستم گلوتاتیون/گلوتاردوکسین احیاء می­شوند. مطالعات پروتئومیکس نشان می­دهد که تیوردوکسین­های نوع h در فرآیندهای متعدد سلولی دخالت دارند. تعدادی از اعمال آن­ها عبارتند از: تحریک جوانه­زنی بذر و رشد و نمو گیاهک (Cazalis et al., 2006)، محافظت سلول در برابر تنش اکسیداتیو (Dos Santos and Rey, 2006 Meyer et al., 2008;)، غیرفعال­سازی پروتئین­های سمی (Joudrier et al., 2005) و محافظت در برابر تنش­های زنده و غیرزنده (Reichheld et al., 2002 Laloi et al., 2004; Park et al., 2009;). تا کنون ژن­های زیادی از این خانواده مطالعه و گزارش شده است. به عنوان مثال، بیان ویژه هشت ژن تیوردوکسین نوع h در گیاه آرابیدوپسیس (Arabidopsis thaliana) مورد بررسی قرار گرفته و نشان داده شد که سطوح بیان این آیزوفرم­ها در بافت­های مختلف گیاه متفاوت بوده و در واکنش به عامل بیماریزای قارچی یکسان بیان نمی­شوند (Reichheld et al., 2002). در مطالعه­ای دیگر بیان شد که ژن TRXh5 در گیاه آرابیدوپسیس در اثر زخم­شدگی، پیری، آلودگی با عامل بیماریزای قارچی و شرایط تنش اکسیداتیو به میزان زیادی در بافت­های مختلف القا می­شود (Laloi et al., 2004). همسانه­سازی و بیان متفاوت سه آیزوفرم ژن تیوردوکسین نوع h تحت تیمار با تنش­های شوری (NaCl) و عامل اکسیداتیو (H₂O₂) در بذور گندم (Triticum aestivum) نشان داد که الگوی بیان سه آیزوفرم در بذور تیمار شده متفاوت است (Cazalis et al., 2006). همچنین، یک تیوردوکسین نوع h به نام AtTrx-h3 از عصاره­های سیتوزولی گیاه آرابیدوپسیس تحت تیمار گرمایی، جداسازی و همسانه­سازی شده و پس از تجزیه و تحلیل­های مربوطه مشخص شد که پروتئین کد شده توسط این ژن، عمدتاً از طریق فعالیت چپرونی موجب افزایش تحمل گرمایی در گیاه آرابیدوپسیس می­شود (Park et al., 2009).

شکل 1- مسیرهای مختلف احیاء تیوردوکسین­ها. احیاء تیوردوکسین­های کلروپلاستی توسط آنزیم فردوکسین- تیوردوکسین ردوکتاز (FTR) انجام می­گیرد، در حالی که در میتوکندری و سیتوزول، تیوردوکسین­ها توسط آنزیم NADPH- تیوردوکسین ردوکتاز (NTR) احیاء می­شوند. تیوردوکسین­های نوع h زیرگروه III می­توانند از طریق سیستم گلوتاتیون/گلوتاردوکسین (GSH/Grx) نیز احیاء شوند (Gelhaye et al., 2005). GR: گلوتاتیون ردوکتاز، GSH: گلوتاتیون در وضعیت احیاء، GSSG: گلوتاتیون اکسید شده، Grx: گلوتاردوکسین.

Figure 1- Different pathways of Trxs reduction. The chloroplastic pathway involves ferredoxin-thioredoxin reductase (FTR). In mitochondria and cytoplasm, thioredoxins could be reduced by NADP thioredoxin reductase (NTR). The h-type Trxs from subgroup III could also be reduced via the glutathione/glutaredoxin (GSH/Grx) system (Gelhaye et al., 2005). GR: glutathione reductase, GSH: reduced form of glutathione, GSSG: oxidized form of glutathione, Grx: glutaredoxin.

با توجه به تنوع و دخالت تیوردوکسین­های نوع h در فرآیندهای متعدد سلولی در گیاهان، شناسایی، همسانه­سازی و بررسی خصوصیات بیوشیمیایی و ساختاری آن­ها ضروری به نظر می­رسد. در این مطالعه جداسازی و همسانه­سازی توالی­های کامل cDNA کدکننده دو آیزوفرم تیوردوکسین نوع h از بافت حبه انگور عسکری در شرایط طبیعی انجام شده، سپس خصوصیات بیوشیمیایی و ساختاری پیش­بینی شده آن­ها مورد بررسی و مقایسه قرار می­گیرد. همچنین نشان داده می­شود که این آیزوفرم­ها به زیرگروه­های متفاوتی از تیوردوکسین­های نوع h تعلق دارند.

مواد و روش­ها

مواد گیاهی و جداسازی RNA کل

بافت حبه در مرحله ترش- شیرین (Veraison) از گیاه انگور عسکری (Vitis vinifera L. cv. Askari)، از مزارع انگور در ایستگاه تحقیقات انگور، وابسته به سازمان تحقیقات کشاورزی و منابع طبیعی استان قزوین، واقع در شهر تاکستان (استان قزوین) جمع­آوری و در همان محل، پس از جداسازی هسته­ها و توزین به مقدار 1 گرم، درون ورقه­های آلومینیومی بسته­بندی شده و بلافاصله درون ازت مایع تثبیت گردید. نمونه­ها به آزمایشگاه منتقل و در دمای 80- درجه سانتیگراد نگهداری شدند. جهت استخراج RNA کل از یک روش بهینه شده در مقیاس کوچک که تغییر یافته روش Reid و همکاران (2006) می­باشد، استفاده شد. بافت مورد نظر با استفاده از هاون چینی و ازت مایع به صورت پودر درآمده و به میزان 1/0 گرم به یک تیوب ml 2 حاوی ml 1 بافر استخراج (300mM Tris-HCl pH 8, 25mM EDTA pH 8, 2% PVP, 2% CTAB, 2M NaCl, 2% β-mercaptoethanol) اضافه گردید. تیوب­ها به مدت 30 دقیقه در دمای 65 درجه سانتی­گراد حمام آب گرم قرار داده شده و هر 5 دقیقه به آرامی ورتکس (Techne-FVORTECE، انگلستان) گردیدند. سپس پروتئین­ها دو مرتبه و با یک حجم برابر از کلروفرم: ایزوآمیل الکل (v/v 24:1) جداسازی گردیده و لایه بالایی به یک تیوب جدید منتقل شده و 1/0 حجم سدیم استات M 3 و 6/0 حجم ایزوپروپانول به آن افزوده و سپس به مدت 30 دقیقه در دمای 80- درجه سانتیگراد نگهداری گردید. رسوب اسید نوکلئیک به وسیله سانتریفیوژ (Hettich-D78532، آلمان) با سرعت rpm 14000 در دمای 4 درجه سانتیگراد جمع­آوری و در آب DEPC حل گردید. سپس 3/0 حجم لیتیوم کلراید M 8 به نمونه­ها اضافه گردیده و تیوب­ها به 6-8 ساعت در دمای 4 درجه سانتیگراد نگهداری شدند. سپس RNA کل به وسیله سانتریفیوژ با سرعت rpm 14000 در دمای 4 درجه سانتیگراد رسوب و با استفاده از الکل اتانول 70% شستشو و در lµ 200 آب DEPC شده حل گردید. کمیت و کیفیت RNA کل استخراجی با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر (Labomed- UVD3200، انگلستان) در طول موج­های 230، 260 و 280 نانومتر و الکتروفورز ژل آگاروز 2/1% مورد بررسی قرار گرفت.

سنتز رشته اول cDNA

رشته اول cDNA با استفاده از gµ 5 محلول RNA کل تیمار شده با آنزیم RNase-free DNase I (Fermentas)، آنزیم نسخه­بردار معکوس RevertAid^TM M-MuiV (Fermentas) و آغازگرهایOligo (dT)₁₈  (Qiagen) سنتز گردید. ترکیب هر واکنش نسخه­برداری شامل (3/8 pH) mM Tris-HCl 50، mM KCl 50، mM MgCl₂4، mM dithiothreitol 10، ng Olig (dT)₁₈ primer 50، µM 500 از هر dNTP و سر انجام RevertAid^TM M-MuLV RT units 200 بود. واکنش نسخه­برداری در دمای 42 درجه سانتی­گراد به مدت یک ساعت انجام و عمل غیر فعال­سازی آنزیم نسخه­بردار معکوس  (RT)در دمای 70 درجه سانتی­گراد به مدت 10 دقیقه صورت گرفت. بدین ترتیب از رشته اول مولکول cDNA به عنوان الگو در واکنش RT-PCR استفاده گردید.

طراحی آغازگرها و واکنش RT-PCR

تکثیر ژن­های VvTrxh4 و VvCxxS2 با استفاده از آنزیم Pfu (Fermentas) و آغازگرهای اولیگونوکلئوتیدی طراحی شده بر اساس توالی بیانی برچسب دار (EST: CB348011 برای ژن VvTrxh4 و EST: EE089310 برای ژن VvCxxS2) شناسایی شده با برنامه BLAST انجام شد. آغازگرهای اختصاصی شامل سه نوکلئوتید اضافی و جایگاه شناسایی آنزیم برشی BamHI در انتهای ′5 بودند که توسط شرکت Metabion آلمان سنتز شدند. مخلوط واکنش در حجم نهایی µl 50 حاوی (8/8 pH) mM Tris-HCl 20، mM (NH₄)₂SO₄10، mM KCl 10، mM MgSO₄2،Triton X-100 1/0%، mg/ml BSA 1/0، µM 500 از هر dNTP، pM 50 از هر آغازگر (رفت و برگشت)، ng 100 DNA الگو و 25/1 واحد از آنزیم Pfu DNA polymerase مورد استفاده قرار گرفت. واکنش RT-PCR با استفاده از یک دستگاه ترموسایکلر قابل برنامه­ریزی (Techne-TC512، انگلستان) در 35 چرخه دمایی انجام شد که شرایط دمایی و زمانی هر چرخه شامل: مرحله واسرشتگی در دمای 94 درجه سانتیگراد به مدت 30 ثانیه، مرحله اتصال در دمای 58 درجه سانتیگراد به مدت یک دقیقه و مرحله تکثیر در دمای 72 درجه سانتیگراد به مدت یک دقیقه بود. همچنین مرحله واسرشتگی اولیه در دمای 94 درجه سانتیگراد به مدت 3 دقیقه و مرحله تکثیر نهایی در دمای 72 درجه سانتیگراد به مدت 10 دقیقه انجام گرفت. آغازگرهای اختصاصی مورد استفاده شامل آغازگر رفت VTrxh4F با توالی 5'-TACGGATCCATGGCGGAAGAGGGACAA-3' و آغازگر برگشت VTrxh4R با توالی 5'-ATCGGATCCTCAAGCAGTTGCATGCTTCT-3' برای تکثیر ژن VvTrxh4 و آغازگر رفت VCxxS2F با توالی 5'-TACGGATCCATGGAAAATCAGGAGCCG-3 و آغازگر برگشت VCxxS2R با توالی 5'-ATCGGATCCCTAGGCTACATACACGCGAAA-3' برای تکثیر ژنVvCxxS2  بود.

همسانه سازی و توالی­یابی DNA

محصولات RT-PCR روی ژل آگارز 8/0% الکتروفورز گردیده، سپس قطعات تکثیر شده با اندازه­های مورد نظر  bp345 و bp 381 از روی ژل بریده شده و با استفاده از کیت استخراج اسید نوکلئیک GF-1 PCR Clean Up Kit (Vivantis) خالص­سازی شدند. قطعات خالص­سازی شده و ناقل پلاسمیدی pUC19 (Fermentas) توسط آنزیم برشی BamHI (Fermentas) هضم گردیده و واکنش اتصال با استفاده از آنزیم DNA لیگاز T4 (Fermentas) انجام گرفت. محصول واکنش اتصال به طور مستقیم و با استفاده از روش شوک حرارتی برای تراریزش سلول­های مستعد باکتری اشریشیاکلی (Escherichia coli) سویه DH5α مورد استفاده قرار گرفت. پس از غربال­گری روی محیط کشت جامد SOB حاوی آنتی­بیوتیک آمپی­سیلین، X-gal و IPTG، پلاسمیدهای نوترکیب با استفاده از روش تحلیل قلیایی با SDS استخراج گردیده (Sambrook and Russell, 2001) و با استفاده از کیت GeneJET^TM Plasmid Miniprep Kit (Fermentas) خالص­سازی وتغلیظ شدند. توالی نوکلئوتیدی قطعات DNA با استفاده از آغازگرهای راه­انداز باکتریوفاژ T7 در دو جهت رفت و برگشت و با روش توالی­یابی Dideoxynucleotide توسط شرکت Seqlab (Sequence Laboratories Gottingen) آلمان انجام شد. لازم به ذکر است که جهت قرارگیری ژن همسانه­سازی شده در ناقل پلاسمیدی pUC19 با استفاده از هضم آنزیمی با آنزیم برشی HinfI (Fermentas) نیز تعیین گردید.

بررسی توالی

خصوصیات بیوشیمیایی پروتئین­های بدست آمده با استفاده از برنامه­های ProtParam، TMHMM، ProtScale و PSORT (http://www.expasy.ch/tools/) مورد بررسی قرار گرفت. همچنین ساختار دوم پروتئین­ها به وسیله برنامه PSIpred (bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred) و ساختار سوم آن­ها با استفاده از برنامه­های SWISS-MODEL و Swiss PDB-viewer (http://www.expasy.ch/tools/) تعیین گردید. درخت فیلوژنتیکی نیز با استفاده از تیوردوکسین­های نوع h گیاهان آرابیدوپسیس، درخت صنوبر، انگور، گندم، جو، برنج، سویا و کلزا و به کمک نرم­افزار ClustalW (http://ClustalW.genome.ad.jp) ساخته شد. شماره دستیابی توالی­های پروتئینی موجود در NCBI که برای ساخت درخت فیلوژنتیکی مورد استفاده قرار گرفتند، عبارتند از: آرابیدوپسیس (Arabidopsis thaliana): At1 (At3g51030)، At2 (At5g39950)، At3 (At5g42980)، At4 (At1g19730)، At5 (At1g45145)، At7 (At1g59730)، At8 (At1g69880)، At9 (At3g08710)، AtCxxS1 (At1g11530)، AtCxxS2 (At2g40790)، AtCxxC2 (At3g56420)؛ درخت صنوبر (Populus trichocarpa): Pt1 (AF483625)، Pt2 (AF483266)، Pt3 (BU822062)، Pt4 (BU835000)، Pt5 (BU869308)، PtCxxS1 (CA823821)، PtCxxS3 (BU874060)؛ انگور (Vitis vinifera): Vv1 (HM370524)، Vv2 (HM370525)، Vv3 (HM370526)، Vv5 (CF513794)، Vv6 (CB004453)، VvCxxS1 (EU280164)؛ گندم (Triticum aestivum): Ta1 (CD886902)، Ta2 (CD892602)، Ta3 (BJ210524)، Ta4 (CD894811)، Ta5 (AF438359)؛ جو (Hordeum vulgare): Hv1 (AY245454)، Hv2 (AY245455)، Hv3 (BI960260)، Hv4 (AF435815)؛ برنج (Oryza sativa): Os1 (Q42443)، Os2 (Q9FRT3)، Os5 (AF435817)، OsCxxS (NP_001053968)؛ سویا (Glycine max): Gm1 (AI461219)، Gm2 (BI699372)، Gm4 (BM188930)، Gm5 (CA799351)، GmCxxS1 (ACU19593)، GmCxxS2 (ACU14856)؛ کلزا (Brassica napus): Bn1 (U59379)، Bn2 (U59380).

نتایج و بحث

بررسی توالی و مقایسه خصوصیات بیوشیمیایی پروتئین­های VvTrxh4 و VvCxxS2

جداسازی و همسانه­سازی قطعات cDNA کدکننده تیوردوکسین­هایVvTrxh4  وVvCxxS2  (ثبت شده در پایگاه توالی نوکلئوتیدی GenBank، به ترتیب با شماره­های دستیابی HM370527 و HM370528) با استفاده از روش RT-PCR انجام شد. نتایج هضم آنزیمی با آنزیم برشی HinfI نشان داد که ژنVvTrxh4  در جهت معمولی و ژن VvCxxS2 در جهت عکس روی ناقل پلاسمیدی pUC19 همسانه­سازی شده­اند که با نتایج توالی­یابی مطابقت دارد (شکل 2). بررسی توالی نوکلئوتیدی نشان داد که چارچوب خواندنی ژن­های همسانه­سازی شده VvTrxh4 و VvCxxS2 به ترتیب  bp345 و bp 381 طول داشته و هر دو ژن با کدون ATG آغاز می­شوند، اما به ترتیب با کدون­های TGA و TAG خاتمه می­یابند (شکل 3).

الف (A)

ب (B)

شکل 2- ساختار ناقل­های نوترکیب pUC19-VvTrxh4 و pUC19-VvCxxS2 و الکتروفورز ژل آگارز 5/1 درصد به منظور تعیین جهت ژن­های همسانه­سازی شده با استفاده از هضم آنزیمی با آنزیم برشی HinfI. الف) ناقل­های نوترکیب pUC19-VvTrxh4 و pUC19-VvCxxS2 به ترتیب حاوی ژن VvTrxh4 در جهت معمولی و ژن VvCxxS2 در جهت عکس روی جایگاه همسانه­سازی چندگانه (MCS) می­باشند. توالی مسؤل رونوشت­برداری ناقل نوترکیب (pMB1)، ژن­های lacZ و مقاومت به آمپی­سیلین (Ap^R) و جایگاه همسانه­سازی چندگانه روی ناقل­های نوترکیب نشان داده شده­اند. ب) نتیجه هضم آنزیمی نشان می­دهد که همسانه­سازی در جهت معمولی منجر به تولید 4 باند شده و در جهت عکس 5 باند تولید می­کند. M) نشانگر مولکولی Kb 1، 1) پلاسمید غیرنوترکیب هضم نشده، 2) پلاسمید غیرنوترکیب هضم شده با آنزیم HinfI، 3) پلاسمید نوترکیب هضم شده با آنزیم HinfI حاوی ژن VvTrxh4 در جهت معمولی، 4) پلاسمید نوترکیب هضم شده با آنزیم HinfI حاوی ژن VvCxxS2 در جهت عکس.

Figure 2- The structure of recombinant vectors of pUC19-VvTrxh4 and pUC19-VvCxxS2 and 1.5% agarose gel electrophoresis to determine the direction of cloned genes using enzymic digestion with HinfI. (A) The recombinant vectors of pUC19-VvTrxh4 and pUC19-VvCxxS2 contain the VvTrxh4 gene in correct direction and VvCxxS2 gene in reverse direction on Multiple Cloning Site (MCS), respectively. The pMB1 sequence, lacZ gene, Ap^R gene, and MCS have been revealed on recombinant vectors. (B) The enzymic digestion displays that cloning in correct and reverse directions products 4 and 5 bonds, respectively. M) 1 Kb DNA ladder, 1) The non-digested pure plasmid, 2) The pure plasmid digested with HinfI, 3) The recombinant plasmid containing the VvTrxh4 gene in correct direction and digested with HinfI, 4) The recombinant plasmid containing the VvCxxS2 gene in reverse direction and digested with HinfI.

الف (A)

ب (B)

شکل 3- توالی نوکلئوتیدی و پروتئینی الف) ژن VvTrxh4 و ب) ژن VvCxxS2. کادرهای آبی رنگ نشان دهنده موتیف­های ساختاری درگیر در انتقال سلول به سلول، کادرهای قرمز تیره رنگ نشان دهنده جایگاه فعال و کادر نارنجی رنگ شامل اسید آمینه تریپتوفان ویژه می­باشند. همچنین کدون­های آغاز و پایان چارچوب باز خواندنی ژن­ها، به ترتیب با رنگ­های سبز و قرمز روشن نشان داده شده­اند.

Figure 3- The nucleotide and protein sequences of (A) VvTrxh4 and (B) VvCxxS2 genes. The potential structural motifs involved in cell-to-cell transfer (blue boxes), the active site (red boxes), and the characteristic tryptophan residue (orange box) are distinguished. The initiation and termination codons of ORFs have been also indicated in green and red, respectively.

بررسی خصوصیات بیوشیمیایی پروتئین­های بدست آمده با استفاده از برنامه ProtParam نشان داد که وزن مولکولی محاسبه شده و نقطه آیزوالکتریک پیش­بینی شده پروتئین VvTrxh4 با 114 اسیدآمینه، به ترتیب برابر 76/12 کیلودالتون و 22/5 بوده، در حالی که پروتئین VvCxxS2 با 126 اسیدآمینه دارای وزن مولکولی محاسبه شده 25/14 کیلودالتون و نقطه آیزوالکتریک پیش­بینی شده 68/4 می­باشد. به طور کلی تیوردوکسین­ها پروتئین­هایی پایدار، با نیمه عمر بالا و مقاوم در برابر حرارت می­باشند (Gelhaye et al., 2005). شاخص ناپایداری پروتئین­ها بیان­گر میزان پایداری آن­ها در لوله آزمایش می­باشد به طوری که پروتئین­هایی با شاخص کمتر از 40 جزء پروتئین­های پایدار تقسیم­بندی می­شوند (Gasteiger et al., 2005). شاخص ناپایداری پروتئین VvTrxh4 در حدود 56/32 محاسبه گردید، اما این شاخص برای پروتئین VvCxxS2 معادل 55/39 تعیین گردید که حاکی از پایداری نسبی پروتئین VvTrxh4 نسبت به پروتئین VvCxxS2 می­باشد. با توجه به وجود یک اسیدآمینه حفظ شده متیونین (Met) در انتهای آمینوی پروتئین­های VvTrxh4 و VvCxxS2، نیمه عمر آن­ها در محیط درون شیشه (in vitro) در حدود 30 ساعت محاسبه گردید (Gasteiger et al., 2005). همچنین شاخص آلیفاتیک (Aliphatic) که به عنوان یک عامل مهم به منظور برآورد مقاومت پروتئین­ها در برابر حرارت می باشد (Kim et al., 2008)، برای پروتئین­های VvTrxh4 و VvCxxS2 به ترتیب معادل 32/91 و 59/86 محاسبه گردید که نشان دهنده مقاوم بودن این پروتئین­ها و به طور کلی تیوردوکسین­ها در برابر حرارت می­باشد (Gelhaye et al., 2004, 2005). ضریب خاموشی پروتئین VvTrxh4 در طول موج nm 280 در محیط آب، در حالت اکسید شده در حدود 303/1 و در حالت احیاء شده برابر 294/1 تعیین گردید، در حالی که این مقادیر برای پروتئین VvCxxS2 به ترتیب معادل 095/1 و 086/1 می­باشد. این اختلاف به دلیل تفاوت در توالی جایگاه فعال آن­ها می­باشد به نحوی که در جایگاه فعال پروتئین VvTrxh4 دو اسیدآمینه سیستئین قرار دارد، اما در جایگاه فعال پروتئین VvCxxS2 تنها یک اسیدآمینه سیستئین وجود دارد (Gasteiger et al., 2005). پیش­بینی موقعیت زیرسلولی این پروتئین­ها با برنامه PSORT نشان داد که برخلاف تعدادی از تیوردوکسین­های نوع h که محل فعالیت­شان درون میتوکندری، هسته و شبکه آندوپلاسمی است (Gelhaye et al., 2004)، پروتئین­های VvTrxh4 و VvCxxS2 از نوع سیتوپلاسمی بوده و محل فعالیت آن­ها درون سیتوزول می­باشد.

مقایسه توالی اسیدآمینه­ای و موتیف­های ساختاری پروتئین­های VvTrxh4 و VvCxxS2

پروتئین VvTrxh4 دارای یک جایگاه فعال معمول WCGPC (Trp-Cys₃₉-Gly-Pro-Cys₄₂) با دو اسیدآمینه سیستئین می­باشد که این توالی حفظ شده در هر سه زیرگروه I، II و III از تیوردوکسین­های نوع h مشاهده می­شود، به طوری که در گیاه انگور، آیزوفرم­های Vv1، Vv2 و Vv3 از زیرگروه I، آیزوفرم Vv5 از زیرگروه II و آیزوفرم Vv6 از زیرگروه III دارای جایگاه فعال WCGPC می­باشند. برخلاف پروتئین VvTrxh4، پروتئین VvCxxS2 دارای یک جایگاه فعال غیرمعمول WCxxS (Trp-Cys₄₅-Ile-Pro-Ser) می­باشد که تنها در تیوردوکسین­های نوع h زیرگروه III مشاهده می­شود. پروتئین VvTrxh4 و به طور کلی تیوردوکسین­ها با جایگاه فعال WCGPC به علت داشتن دو اسیدآمینه Cys در جایگاه فعال خود، در حالت اکسید شده یک پیوند دی­سولفیدی تشکیل می­دهند که در آرایش فضایی به شکل بیرون­زدگی از سطح پروتئین خارج شده و در معرض حمله نوکلئوفیلی آنزیم NTR قرار گرفته و احیاء می­شود (Spyrou et al., 1997؛ Joudrier et al., 2005). در حالت احیاء شده، هر دو اسیدآمینه Cys در فعالیت­های کاتالیتیکی تیوردوکسین­ها دخالت نموده و موجب احیاء پیوندهای دی­سولفیدی در پروتئین­های هدف می­شود. به هر حال وجود پیوند دی­سولفیدی در تیوردوکسین­های واقعی WCGPC موجب می­شود که ضریب خاموشی آن­ها در حدود mv 290- شده و توسط آنزیم NTR احیاء شوند (Gelhaye et al., 2005). در مقابل، پروتئین VvCxxS2 مشابه با تیوردوکسین­های ناهنجار CxxS به دلیل فقدان دومین اسیدآمینه Cys در جایگاه فعال و عدم تشکیل پیوند دی­سولفید، دارای ضریب خاموشی در حدود mv 200- بوده و در نتیجه همانند تیوردوکسین­های واقعی WCGPC عمل نکرده و نمی­توانند توسط آنزیم NTR احیاء شوند. این گروه از تیوردوکسین­ها توسط سیستم گلوتاردوکسین/گلوتاتیون احیاء می­شوند (Gelhaye et al., 2003). تمام تیوردوکسین­های نوع h که تاکنون شناسایی شده­اند، دارای یک اسیدآمینه تریپتوفان ویژه می­باشند که یک حداکثر جذب نور UV در طول موج nm 290 را به تیوردوکسین­ها می­دهد (Gelhaye et al., 2004). این اسیدآمینه تریپتوفان ویژه، در پروتئین­های VvTrxh4 و VvCxxS2 به ترتیب در موقعیت­های 16 و 22 مشاهده می­شود. بررسی­ها با برنامه TMHMM نشان داد که هر دو پروتئین جزء پروتئین­های خارج سلولی بوده و می­توانند انتقال پلاسمودسمایی داشته باشند که برای این انتقال به موتیف­هایی در انتهای آمینو و انتهای کربوکسیل نیازمند می­باشند (Ishiwatari et al., 1998؛ Meng et al., 2010). در انتهای آمینوی پروتئین VvTrxh4 و سایر تیوردوکسین­های نوع h زیرگروه I انگور، یک موتیف MAEE و در انتهای کربوکسیل آن و آیزوفرم­های Vvh2 و Vvh3، نیز یک موتیف KREE مشاهده می­شود. در حالی که موتیف­های ساختاری درگیر در انتقال سلول به سلول در پروتئین VvCxxS2 نسبت به آنچه که در پروتئین VvTrxh4 مشاهده شد، متفاوت می­باشد، به طوری که در انتهای آمینوی آن یک موتیف MENQE و در انتهای کربوکسیل، موتیف NPDE مشاهده می گردد.

بررسی ساختار دوم و مدلسازی مولکولی پروتئین­های VvTrxh4 و VvCxxS2

بررسی ساختار دوم پروتئین­های VvTrxh4 و VvCxxS2 با استفاده از برنامه PSIpred (شکل4) نشان داد که این پروتئین­ها و به طور کلی تیوردوکسین­ها، حاوی 5 صفحه β و 4 مارپیچ α می باشند که به ترتیب β1α1β2α2β3α3β4β5α4 در ساختار دوبعدی پروتئین قرار می­گیرند (Peterson et al., 2005). پروتئین VvTrxh4 شامل 51/53% اسیدآمینه آب­دوست و 49/46% اسیدآمینه آب­گریز می­باشد. به طور مشابه، 79/50% و 21/49% پروتئین VvCxxS2 را، به ترتیب اسیدهای آمینه آب­دوست و آب­گریز تشکیل می­دهد. توزیع اسیدهای آمینه در بین مارپیچ­های α، صفحات β و نواحی مارپیچ پیچیده در هر دو پروتئین تقریباً مشابه می­باشد. پروتئین VvTrxh4 حاوی 11/42% مارپیچ α، 82/29% صفحه β و 07/28% مارپیچ پیچیده بوده و پروتئین VvCxxS2 نیز از 10/38% مارپیچ α، 19/26% صفحه β و 71/35% مارپیچ پیچیده تشکیل شده است. در بین صفحات β، بلندترین صفحه مربوط به صفحات β4 و  β5 با 8 اسیدآمینه و کوتاه­ترین صفحه مربوط به صفحه β1 با 3 اسیدآمینه و در بین مارپیچ­های α، بلندترین و کوتاه­ترین مارپیچ به ترتیب مربوط به α2 با 16 اسیدآمینه و α3 با 6 و 7 اسیدآمینه در هر دو پروتئین می­باشد. همان طور که در شکل 3 مشاهده می­شود، توالی جایگاه فعال در هر دو پروتئین مابین انتهای کربوکسیل صفحه β2 و انتهای آمینوی مارپیچ α2 قرار گرفته، اسید­آمینه تریپتوفان ویژه چهارمین اسیدآمینه مارپیچ α1 را تشکیل داده و موتیف­های ساختاری درگیر در انتقال سلول به سلول، شامل موتیف انتهای آمینو و انتهای کربوکسیل، به ترتیب درون اولین ساختار مارپیچ پیچیده و بین صفحه β5 و مارپیچ α4 قرار گرفته­اند. بررسی ساختار سه­بعدی پروتئین­های VvTrxh4 و VvCxxS2 بوسیله برنامه­های Swiss-MODEL و Swiss PDB-viewer، به ترتیب با استفاده از ساختار کریستالی آیزوفرم­های At1 از آرابیدوپسیس (با شماره دستیابی 1xflA در پایگاه PDB) و Hv1 از جو (با شماره دستیابی 2vlvB در پایگاه PDB) به عنوان یک نمونه نشان داد که صفحات β1، β2، β3 و β5 به صورت هم­جهت و صفحه β4 به صورت غیر هم­جهت، طوری کنار هم قرار می­گیرند که یک صفحه چین­دار مرکزی را تشکیل داده و توسط مارپیچ­های α احاطه می­شوند (شکل 4). این نوع سازمان­دهی به عنوان پیچ و تاب­خوردگی مختص تیوردوکسین­ها (Thioredoxin Fold) شناخته شده و برای فعالیت جایگاه فعال بسیار ضروری است (Jacquot et al., 1997).  

الف (A)

ب (B)

شکل 4- ساختار دوبعدی پروتئین­های الف) VvTrxh4 و ب) VvCxxS2 با استفاده از برنامه PSIpred. جایگاه فعال، موتیف­های ساختاری درگیر در انتقال سلول به سلول و اسیدآمینه تریپتوفان ویژه به ترتیب با رنگ­های قرمز، آبی و نارنجی نشان داده شده­اند.

Figure 4- The secondary structure of (A) VvTrxh4 and (B) VvCxxS2 proteins using PSIpred program. The active site, the potential structural motifs involved in cell-to-cell transfer, and the characteristic tryptophan residue have been indicated in red, blue, and orange, respectively.

نحوه آرایش مارپیچ­های α در اطراف صفحات مرکزی β به گونه­ای می­باشد که مارپیچ­های 1α و α3 در یک طرف و مارپیچ­های α2 و 4α نیز در طرف دیگر صفحات β قرار دارند. مارپیچ­های 1α، α2 و 4α در وضعیت موازی با یکدیگر و صفحات β قرار داشته در حالی که مارپیچ α3 به صورت عمود بر مارپیچ­های α و صفحات β واقع شده است. اسیدهای آمینه جایگاه فعال به شکل بیرون­زدگی در انتهای کربوکسیل صفحه β2 و آغاز مارپیچ α2 قرار گرفته­اند به طوری که اسیدآمینه Cys₃₉ نسبت به اسیدآمینه Cys₄₂ در واکنش دی­تیول/دی­سولفید، بیشتر در معرض حمله نوکلئوفیلی قرار دارد (Spyrou et al., 1997). همان طور که در شکل 5 مشاهده می­شود، مارپیچ­های α بیشترین تماس را با محیط آبی داشته، در حالی که صفحات β تا حدامکان از محیط آبی فاصله گرفته­اند. این طرز قرارگیری در فضای سه­بعدی به ماهیت اسیدآمینه­ای تشکیل دهنده مارپیچ­ها و صفحات مربوط می­شود، به نحوی که صفحات β بیشتر از اسیدهای آمینه آب­گریز و مارپیچ­های α از اسیدهای آمینه آب­دوست تشکیل شده­اند. در پروتئین VvTrxh4 صفحات β شامل 82/58% اسیدآمینه آب­گریز و مارپیچ­های α حاوی 50/62% اسیدآمینه آب­دوست می­باشند و به طور مشابه، در پروتئین VvCxxS2، صفحات β شامل 64/63% اسیدآمینه آب­گریز و مارپیچ­های α حاوی 17/54% اسیدآمینه آب­دوست هستند. جایگاه فعال، اسیدآمینه تریپتوفان ویژه و سایر موتیف­های ساختاری درگیر در انتقال سلول به سلول در پروتئین­های VvTrxh4 و VvCxxS2 به صورت مشخص در شکل 5 نشان داده شده­اند. نتایج بدست آمده با سایر نتایج حاصله مشابه می­باشد (Peterson et al., 2005؛ Maeda et al., 2003).

 الف (A)                                              ب (B)

شکل 5- ساختار سه­ بعدی پروتئین­های الف) VvTrxh4 و ب) VvCxxS2 با استفاده از برنامه­های SWISS-MODEL و Swiss PDB-viewer. مارپیچ­های α، صفحات β و نواحی مارپیچ پیچیده به طور مشخص در ساختارهای سه­بعدی قابل مشاهده می­باشند. همچنین اسیدهای آمینه جایگاه فعال، اسیدهای آمینه موجود در موتیف های ساختاری درگیر در انتقال سلول به سلول و اسیدآمینه تریپتوفان ویژه به ترتیب با رنگ­های قرمز، آبی و نارنجی نشان داده شده­اند. نحوه تشکیل پیوند دی­سولفیدی بین دو اسیدآمینه سیستئین جایگاه فعال پروتئین VvTrxh4 نیز در شکل 5- الف قابل مشاهده می­باشد.

Figure 5- The 3D structure of (A) VvTrxh4 and (B) VvCxxS2 proteins using SWISS-MODEL and Swiss PDB-viewer programs. The α-helices, β-sheets, and coiled coil regiones are distinguished in the 3D structures. The residues in the active site sequence, the potential structural motifs involved in cell-to-cell transfer, and the characteristic tryptophan residue have been also indicated in red, blue, and orange respectively.

بررسی فیلوژنتیکی آیزوفرم­ها

بررسی فیلوژنتیکی آیزوفرم­های VvTrxh4 و VvCxxS2 با تیوردوکسین­های نوع h گیاهان آرابیدوپسیس، درخت صنوبر، انگور، گندم، جو، برنج، سویا و کلزا به روش Unrooted-Neighbor Joining با استفاده از نرم افزار ClustalW نشان داد که تیوردوکسین­ها به سه زیرگروه بزرگ I، II و III تقسیم­بندی شده، به طوری که آیزوفرم VvTrxh4 به زیرگروه I و آیزوفرم VvCxxS2 به زیرگروه III تعلق دارند (شکل 6). Gelhaye et al. (2005) با بررسی­های فیلوژنتیکی نشان دادند که تیوردوکسین­های نوع h بر اساس توالی اولیه پروتئینی و موقعیت زیرسلولی به سه زیرگروه مختلف و هر زیرگروه به چند کلاس متفاوت تقسیم­بندی می­شوند. تیوردوکسین­های نوع h زیرگروه I (hI) با جایگاه فعال WC[G/P]PC، سیتوزولی بوده و بدلیل داشتن موتیف­های ساختاری درگیر در انتقال سلول به سلول، در تنظیم ردوکس ترکیبات بافت آوندی دخالت داشته، و قبل از انتقال از طریق پلاسمودسماتا به درون عناصر آوند آبکش، در سلول­های جانبی بافت آوند آبکشی سنتز می­شوند (Gelhaye et al., 2004, 2005). تیوردوکسین­های hI به سه کلاس IA، IB و IC تقسیم­بندی می­شوند که آیزوفرم VvTrxh4 به همراه آیزوفرم­های Vv1، Vv2 و Vv3 انگور به کلاس IA تعلق دارند. کلاس­های IB و IC علاوه بر تیوردوکسین­هایی از گیاهان آرابیدوپسیس و کلزا، شامل تیوردوکسین­هایی از غلات نیز می­باشند. تیوردوکسین­های موجود در کلاس IB، در موقعیت 101 توالی پروتئینی خود، دارای یک اسیدآمینه آب­دوست یا باردار (R، K یا N) می­باشند، در حالی که اسیدآمینه موجود در موقعیت مشابه توالی پروتئینی تیوردوکسین­های کلاس IC، یک اسیدآمینه آب­گریز (A، I یا M) است. این اسیدآمینه به عنوان اولین اسیدآمینه موتیف ساختاری RKDD بوده که برای انتقال پروتئین از طریق پلاسمودسماتا بسیار حیاتی می­باشد (Gelhaye et al., 2005). نکته جالب در مورد آیزوفرم­های VvTrxh4 و VvCxxS2 این است که با اینکه این آیزوفرم­ها به زیرگروه­های متفاوتی تعلق دارند، اما اسیدآمینه موجود در موقعیت 100 توالی پروتئینی آن­ها (مشابه با موقعیت 101 کلاس­های IB و IC)، مشابه با تیوردوکسین­های کلاس IB بوده و به ترتیب یک اسیدآمینه باردار (K) و یک اسیدآمینه آب­دوست (N) می­باشد. تیوردوکسین­های نوع h زیرگروه II (hII) با جایگاه فعال WCGPC، دارای یک انتهای آمینو با طول زیاد بوده (Gelhaye et al., 2004) و شامل آیزوفرم Vv5 انگور و تیوردوکسین­های At2، At7 و At8 آرابیدوپسیس می­باشد. سومین زیرگروه از تیوردوکسین­های نوع h (hIII) به دو کلاس IIIA و IIIB تقسیم­بندی می­شوند (Gelhaye et al., 2005): کلاس IIIA شامل تیوردوکسین­هایی با جایگاه فعال معمول WCGPC، از قبیل آیزوفرم Vv6 انگور بوده و دارای یک انتهای آمینو با طول زیاد می­باشند که در موقعیت چهارم خود، یک اسیدآمینه Cys دارند. آزمایش­های جهش­زایی نشان می­دهد که این اسیدآمینه به همراه دو اسیدآمینه Cys موجود در جایگاه فعال، در واکنش کاتالیتیکی با گلوتاردوکسین­ها (Grxs) دخالت دارند. کلاس IIIB نیز از تیوردوکسین­های ناهنجار CxxS تشکیل شده و از جمله این تیوردوکسین­ها می­توان به آیزوفرم­های VvCxxS1 و VvCxxS2 انگور اشاره نمود (شکل 6). بررسی فیلوژنتیکی در مورد تقسیم­بندی تیوردوکسین­های نوع h گیاهان آرابیدوپسیس، درخت صنوبر، انگور، گندم، جو، برنج، سویا و کلزا، مشابه با نتایج موجود می­باشد (Gelhaye et al., 2004, 2005).

با توجه به تنوع، گستردگی و دخالت تیوردوکسین­ها در فرآیندهای متعدد سلولی در گیاهان، شناسایی، جداسازی، همسانه­سازی، بررسی فعالیت کاتالیتیکی، بررسی بیان آیزوفرم­های مختلف تیوردوکسین در سطح RNA و پروتئین در بافت­های مختلف گیاهان زراعی و باغی و انتقال به گیاهان مدل و بررسی فعالیت آن­ها تحت تنش­های زنده و غیرزنده توصیه می­شود تا بتوان اطلاعات بیشتری از این پروتئین­های کوچک، فراوان و مقاوم در برابر حرارت بدست آورده و گیاهانی متحمل به تنش­های محیطی تولید نمود.

سپاسگزاری

نویسندگان مراتب تشکر و قدردانی خود را از همکاری صمیمانه مدیریت محترم سازمان تحقیقات کشاورزی و منابع طبیعی استان قزوین، جناب آقای دکتر نوری و مدیریت محترم مرکز تحقیقات انگور تاکستان، جناب آقایان دکتر نجاتیان، مهندس رسولی و مهندس فدائی که ما را در امر نمونه­برداری یاری نمودند، ابراز می­دارند.