فیتازها: از دیدگاه آنزیم شناسی، ویژگی‏های مولکولی، بیوشیمیایی و کاربردها

فیتازها: از دیدگاه آنزیم شناسی، ویژگی‏های مولکولی، بیوشیمیایی و کاربردها

محمدرضا ساریخانی¹*، محمدعلی ملبوبی²

1 استادیار گروه خاکشناسی، دانشکده کشاورزی دانشگاه تبریز

2 دانشیار گروه بیوتکنولوژی گیاهی، پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست فناوری

تاریخ دریافت: 19/11/1389، تاریخ پذیرش: 27/06/1390

چکیده

فیتازها گروه ویژه‏ای از فسفاتازها می‏باشند که هیدرولیز مرحله به مرحله فسفات را از مولکول فیتات انجام می‏دهند، فیتات منبع اصلی ذخیره فسفات در دانه گیاهان می‏باشد. این دسته از آنزیم‏ها در بین گیاهان، ریزسازواره‏ها و حیوانات پراکندگی و گستردگی دارند ولی از این میان فیتازهای میکروبی امیدبخش بوده و مورد توجه می‏باشند. آنزیم فیتاز به جیره غذایی حیوانات تک معده‏ای از قبیل خوک، پرندگان و ماهی‏ها به منظور افزایش جذب فسفات موجود در جیره غذایی و همچنین کاهش آلودگی فسفات در محیط اضافه می‏شود. نزدیک به 20 سال پیش اولین محصول فیتاز تجاری وارد بازار شد. فیتازها براساس ویژگی‏های بیوشیمیایی و همردیفی توالی اسیدآمینه، در چهار گروه اصلی هیستیدین اسید فسفاتاز، بتا پروپلر فیتاز، سیستئین فسفاتاز و اسید فسفاتاز بنفش قابل تقسیم بندی می‏باشند. به طور معمول، فیتازها همانند یک آنزیم تک واحدی با وزن مولکولی 40 تا 100 کیلودالتون عمل می‏کنند. تا به حال دو گروه عمده از فیتازها یعنی فیتازهای اسیدی با pH بهینه حوالی 5 و فیتازهای قلیایی با pH بهینه 8  شناسایی شده است، با این حال اغلب فیتازها دارای pH و دمای بهینه 6-5/4 و °C 60-45 هستند. برخی از فیتازها دارای اثرگذاری بر محدوده وسیعی از سوبستراها هستند و فیتات عاری از فلز را هیدرولیز می‏کنند و در مقابل برخی بر تعداد کمی‏آز سوبستراها تاثیرگذار بوده و به صورت خاص فیتات کلسیم را هیدرولیز می‏نماید. فیتازها از نظر تعداد گروه‏های فسفاتی که می‏توانند رها سازند متفاوت بوده و معمولاً قادرند 3 تا 5 گروه فسفات از مولکول فیتات را آزاد نمایند. این مقاله مروری بر آنزیم شناسی، کاربرد فیتازها و ویژگی‏های بیوشیمیایی و آنزیمی‏آنها خواهد داشت.

واژه های کلیدی: جیره غذایی حیوانات، فسفر، فیتات، فیتاز

مقدمه

نزدیک به یک قرن از تحقیق بر روی فیتاز، بعد از کشف آن توسط Suzuki et al (1907) می‏گذرد. فیتازها گروه ویژه‏ای از فسفاتازها یا فسفریک مونواستر هیدرولازها به حساب می‏آیند که قادر به هیدرولیز فیتات می‏باشند و حداقل یک گروه فسفات را از این ماده آزاد می‏نمایند (Haefner et al., 2005). این دسته از آنزیم‏ها در طبیعت گسترده هستند و فعالیت فیتازی در گیاهان، جانوران و ریزسازواره‌ها گزارش شده است (Greiner and Konietzny, 2006).

در طول دو دهه گذشته فیتازها در حیطه‏های تغذیه، حفاظت از محیط زیست و بیوتکنولوژی مورد توجه دانشمندان و حافظان محیط زیست قرار گرفته‏اند. این دسته از آنزیم‏های هیدرولیزکننده قادر به رها سازی فسفات به صورت مرحله‏ای از فیتات بوده که منبع اصلی ذخیره فسفر در دانه گیاهان می‏باشد و معمولاً در جیره غذایی حیوانات مورد استفاده قرار می‏گیرند (Reddy et al., 1982). به خاطر این که حیوانات تک معده‏ای[1] از قبیل خوک ها، پرندگان و ماهی ها (همچنین انسان) فاقد آنزیم فیتاز در سیستم گوارشی خود بوده یا فعالیت فیتازی آنها بسیار پایین می‏باشد، قادر به استفاده از فسفر موجود در ساختار فیتات نمی‏باشند. بنابراین، برای تامین فسفر لازم است که فسفر به شکل معدنی و قابل جذب به غذای آنها اضافه شود (Lei and Stahl, 2001; Lei and Porres, 2003). استفاده از فسفر معدنی، که غالباً به اشکال مونوکلسیم فسفات و دی کلسیم فسفات می‏باشد همراه با مشکلاتی خواهد بود. اولاً علاوه بر هزینه بالای این عنصر و تخلیص آن، منابع محدود و تجدید ناپذیری[2] دارد، به طوریکه منابع فسفات بر روی کره خاکی تا 50 سال آینده تخلیه خواهند شد (Lei et al., 2007). ثانیاً رها سازی آن در محیط، به ویژه در اکوسیستم‏های آبی و مناطقی که واحدهای پرورش دام زیاد است مخاطرات زیست محیطی و آلودگی محیط (رشد جلبکها)[3] را به دنبال خواهد داشت. ثالثاً فیتات به عنوان یک عامل ضد تغذیه‏ای[4] نیز شناخته می‏شود. زیرا می‏تواند از طریق کلات نمودن کاتیون‏های فلزی دو ظرفیتی از قبیل Ca²⁺، Mg²⁺، Zn²⁺ و Fe²⁺ با تشکیل کلات‏های نامحلول از دسترسی آن برای موجود زنده بکاهد (Afinah et al., 2010; Lei and Stahl, 2001)، همین ویژگی آن در مورد ویتامین‏ها و پروتئین‏ها و اسیدآمینه‏ها نیز صادق بوده و با تشکیل کمپلکس‏های نامحلول آن‏ها را از دسترس میزبانان خود خارج می‏سازد. همچنین فیتات ممکن است در هضم چربی‏ها و نشاسته اختلال ایجاد نماید (Cao et al., 2007). بدون شک افزایش توجه عمومی به مسایل محیطی، بهبود تغذیه دام و سلامت انسان باعث توجه به توسعه بیوتکنولوژی فیتازها و کاربرد آنها در حیطه‏های مربوطه شده است. به طوری که افزودن آن‏ها در جیره غذایی دام[5] و در نظر گرفتن سایر عوامل تغذیه‏ای تا 50 درصد می‏تواند در بهبود جذب فسفر کمک نماید (Lei et al. 1993 a, b). بنابراین به دلایل اقتصادی و محیطی، فیتازها و از جمله فیتازهای میکروبی مورد توجه و علاقه می‏باشند. اولین فیتاز تجاری تولید شده به وسیله ریزسازواره‏های اصلاح شده در اواسط سال 1991 وارد بازار شد (Greiner and Konietzny, 2006; Cao et al., 2007). فروش سالانه فیتازها، به عنوان ماده افزودنی به جیره غذایی دام 500 میلیون دلار برآورد شده است (Vats and Banerjee, 2004). اخیراً استفاده از آنها در غذای انسان[6] به منظور افزایش فراهمی زیستی عناصر معدنی در نتیجه کاهش فیتات غذاها نیز مورد توجه واقع شده است گر چه تا کنون برای کاربرد در غذای انسان وارد بازار نشده است (Greiner and Konietzny, 2006).

فیتات

اسید فیتک اولین بار در سال 1872 به وسیله پففر کشف شد (Dvorakova, 1998)، فرمول مولکولی آن C₆H₁₈O₂₄P₆ و وزن مولکولی آن 86/659 می‏باشد و نمک‏های آن به نام فیتات شناخته می‏شوند و فیتات کلسیم/منیزیم به نام فیتین[7] مشهور می‏باشد (Mullaney and Ullah, 2005; Vohra and Satyanarayana, 2003). فیتات‏ها از جمله اشکال فسفر آلی می‌باشند که در حدود 50 تا80 درصد فسفر موجود در بقایای گیاهی را به خود اختصاص می‏دهند (Vohra and Satyanarayana, 2003; Haefner et al., 2005). اسید فیتیک 1 تا 5 درصد وزنی دانه غلات، دانه‏های روغنی و دانه‏های لگوم‏ها را به خود اختصاص می‏دهد (Vohra and Satyanarayana, 2003). اسید فیتیک با توجه به pH محیط و غلظت کاتیون‏ها می‏تواند پروتون جذب کند[8] یا پروتون از دست بدهد که به ترتیب در pH اسیدی و قلیایی این اتفاق می‏افتد و باعث پیدایش بار مثبت و منفی در مولکول فیتات شده و فیتات عاری از فلز و فیتات‏ همراه با کاتیون فلزی را ایجاد می‏نماید (Oh et al., 2004). فیتات در خلال جوانه زنی بذور به وسیله آنزیم فیتاز تجزیه می‏شود و فسفات و مواد معدنی را برای جوانه‏های در حال رشد فراهم می‏کند (Reddy et al., 1982).

فیتازها

گروه‏بندی فسفاتازهای باکتریایی بر اساس خصوصیات بیوشیمیایی و بیوفیزیکی آنزیم از قبیل pH بهینه (اسیدی، خنثی یا بازی)، پروفیل سوبسترایی (ویژه یا غیر ویژه برای یک سوبسترای خاص)، وزن مولکولی (وزن مولکولی بالا در مقابل پایین) انجام شده است. یکی از مشهورترین و کاربردی‏ترین آنها،  آنزیم  (myo-inositol hexakisphosphate phosphohydrolase) می‏باشد که قادر به هیدرولیز اسید فیتیک (myo-inositol hexakisphosphate) به فسفات معدنی و مایواینوزیتول فسفات است (شکل 1). فیتازها به گروهی از آنزیم‏ها اطلاق می‏شود که حداقل یک گروه فسفات از مولکول فیتات را جدا نماید (Haefner et al., 2005).

شکل 1- هیدرولیز مولکول فیتات توسط آنزیم فیتاز.

Figure 1- Hydrolysis of phytate molecule by phytase enzyme.

 کمیته نامگذاری آنزیم اتحادیه بین المللی بیوشیمی[9] سه گروه از آنزیم‏های فیتاز به نام‌های 3-فیتاز (EC 3.1.3.8)، 6-فیتاز (EC 3.1.3.26) و 5-فیتاز (EC 3.1.3.72) را با توجه به شماره کربن حلقه اینوزیتول که گروه فسفات آن توسط آنزیم برداشته می‌شود ارائه داده است. مطالعات ژنتیکی فیتازها در سال 1984 شروع شد. اولین و شاید بهترین فیتاز شناخته شده فیتاز Phy A مربوط به A.niger است، که به وسیله یک قطعهkb  4/1 رمز می‏شود و وزن مولکولی آن kDa80 می‏باشد (Ehrlich et al., 1993). همچنین تعدادی از ژن‏های رمزکننده فیتاز از قارچ، گیاهان و باکتری‏ها همسانه‏سازی شده‌اند (Haefner et al., 2005).

منابع میکروبی فیتاز

فیتازها از قارچها، مخمرها، باکتریها و پروتوزاها جداسازی شده‏اند. فعالیت فیتازی میکروبی اغلب در قارچ‏ها به ویژه در گونه آسپرژیلوس شناسایی شده است. Shieh and War (1968) بیش از 2000 ریزسازواره جداسازی شده از خاک را به منظور تولید فیتاز غربال کردند. اغلب جدایه‏های مثبت دارای فعالیت فیتازی درون سلولی بودند. فعالیت فیتازی برون سلولی فقط در 30 جدایه  مشاهده شد که همه آنها مربوط به قارچ‏های رشته‌ای می‌شدند. گونه A. niger یکی از بهترین تولید کننده‌های فیتاز برون سلولی (phyA) است. فیتازهایی قارچی و مخمری بیشتر از نوع 3- فیتاز بوده وگلیکوزیله شده می‏باشند که در برخی موارد تا 35 درصد وزن مولکولی آنها را تشکیل می‏دهند. فیتازهای باکتریایی مانند فیتاز E. coli (AppA/A2) غیر گلیکوزیله هستند. این فیتاز در مقایسه با فیتاز قارچی به دلیل pH بهینه اسیدی، مقاومت به پپسین و فعالیت ویژه بالا نسبت به فیتات در رهاسازی فسفر از جیره غذایی خوک و طیور موثرتر است (Lei et al., 2007). فیتازها در باکتریهای گِرم منفی (نظیر E.coli، Pseudomonas، Klebsiella) و باکتریهای گِرم مثبت (نظیر Bacillus) شناسایی شده است. اسیدفسفاتاز/ فیتاز (ژن‏هایapp A و app A2) از باکتری E. coli جداسازی و مورد شناسایی قرار گرفته‏اند. دو وظیفه‌ای بودن این آنزیم‏ها، آنها را برای انحلال فسفر آلی خاک جذاب نموده است (Greiner et al., 1993). ژن‏های رمزکننده فیتاز با pH بهینه خنثی اخیراً از باکتری‏های B. subtilis وB. licheniformis  همسانه‏سازی شده‌اند (Kerovou et al., 1998; Tye et al., 2002). ژن‏های رمزکننده فیتاز پایدار در برابر گرما (phy) از Bacillus sp. DS11 و ازB. subtilis VTT E-68013  همسانه‏سازی شده‌اند (Rodriguez et al., 2006; Konietzny and Greiner, 2004; Pandy et al., 2001;). جداسازی و توالی‌یابی ژن phyA از کتابخانه ژنومی Obesumbacterium proteus نیز گزارش شده است(Zinin et al., 2004) . Sarikhani et al (2010) در مطالعه ای اقدام به ارائه روشی برای جداسازی ژن‏های رمز کننده فسفاتاز باکتریایی نمودند و در ادامه کتابخانه ژنومی Pseudomonas putida سویه P13 را در محیط Sperber بعلاوه BCIP غربالگری نمودند، آنها به به کار بردن این روش غربالگردی عملکردی موفق به جداسازی دو ژن رمز کننده فسفاتاز و فیتاز شدند که با فسفاتازهای شناخته شده فعلی هیچ گونه مشابهتی نداشتند (Sarikhani et al., 2011). حضور فیتاز در پروتوزاهایی مانند Paramecium tetraurelia و Shewanella oneidensis به اثبات رسیده و در برخی از موارد به دلیل قابلیت فعالیت آنها در دماهای پایین استفاده از آنها در اکوسیستم‏های آبی[10](یا در پرورش ماهی) مناسب به نظر می‏رسد (Lei et al., 2007). در جدول 1 اطلاعات فیتازهای مختلف آورده شده است. ذکر این نکته ضروری می‏باشد که در مطالعات انجام گرفته بر روی منابع مختلف فیتازی، برخی از مطالعات بر روی ریزسازواره بومی و بدون همسانه‏سازی ژن رمزکننده فیتاز بوده است و برخی به همراه همسانه‏سازی ژن رمزکننده فیتاز[11] و انتقال آن به سویه‌های بیانی باکتریایی از قبیل E. coli (BL21, DE3) یا مخمری مانند Pichia pastoris می‏باشد. با این توضیح مشخص است که واژه آنزیم درون سلولی یا برون سلولی مربوط به فیتازهای طبیعی[12] می‏باشد.

منابع غیر میکروبی فیتازها

علاوه بر ریزسازواره‏ها که منبع خوبی برای تولید فیتاز به شمار می‏روند، فیتازها با منشاء گیاهی و حیوانی هم وجود دارند. فیتاز دارای گستردگی خوبی در سلسله گیاهان است و فیتاز از غلات (نظیر گندم، ذرت، جو، برنج و ...) و حبوبات و سایر گیاهان جداسازی و مورد بررسی قرار گرفته ‏است. آنزیم‏های فیتاز اغلب در بذر و دانه گرده گیاهان عالی از قبیل غلات، لگوم‏ها، دانه‏های روغنی و مغزدارها[13] بوده و به میزان کمتر در ریشه گیاهان وجود دارد (Reddy et al., 1982, 1989). فعالیت فیتازی در موقع جوانه زدن بذر و دانه گرده به کار می‏آید. در بذر گیاهان به هنگام جوانه زدن فعالیت فیتازی افزایش سریعی نشان می‏دهد (Dvorakova, 1998).

nd : (Not determined) اندازه گیری نشده است

^1*:  همه اندازه گیری ها در دمای c◦ 37 بوده است به جز این مورد که در دمایc◦ 70 می‏باشد.

فیتاز ترشح شده از ریشه گیاهان بیشتر برای رهاسازی فسفات از منابع آلی فسفر در خاک موثر واقع می‏شود. بیشترین فعالیت فیتازی در غلاتی چون چاودار، جو و گندم (U/Kg 7000 -100) گزارش شده است و معمولاً لگوم‏ها و گیاهان دانه روغنی تا 10 برابر فعالیت فیتازی (U/Kg 450-0) کمتری دارند (Konietzny and Greiner, 2002; Greiner and Konietzny, 2006). این در حالی است که کارآیی زیستی فیتازهای غلات در مقایسه با فیتازهای میکروبی (قارچی) تنها 40 درصد می‏باشد (Haefner et al., 2005). منبع حیوانی یا بافت های حیوانی[14] یکی دیگر از منابع فیتاز می‏باشد و در ترشحات روده‏ای موش، خرگوش، انسان و غیره گزارش شده است. فیتاز همچنین در جانوران با سیستم گوارشی ساده نیز وجود دارد ولی نقش قابل توجهی در تجزیه فیتات بازی نمی‏کند (Kerovuo, 2000; Konietzny and Greiner, 2002). اغلب فیتازهای گیاهی از نوع HAP می‏باشند گرچه PAP ها هم در بین آنها مشاهده می‏شود. این دسته از فیتازها از نوع 6- فیتاز می‏باشند هر چند که در بین آنها 3- فیتاز مانند (Lupin LPl1 and LPl2) نیز گزارش شده است.

ویژگی‏های بیوشیمیایی و مولکولی فیتازها

1- وزن مولکولی

بیشتر فیتازها پروتئین‏های تک واحدی[15] هستند با این حال برخی از آنها دارای چندین زیرواحد می‏باشند به عنوان نمونه فیتاز (Phy B) با منشا A. niger که 4 واحدی[16] است یا 4 زیرواحد دارد. وزن مولکولی این آنزیم بسیار متغیر بوده و بین 100-38 کیلودالتون تغییر می‏کند. در مقایسه با فیتازهای پروکاریوتی فیتازهای قارچی و مخمری (یوکاریوتی) به دلیل گلیکوزیله شدن (اضافه شدن قند) دارای وزن مولکولی بالاتری هستند که در برخی موارد تا 35 درصد وزن مولکولی آنها را تشکیل می‏دهد. در برخی موارد افزوده شدن قند به آنزیم هیچ تاثیری بر فعالیت ویژه و پایداری آنزیم در دماهای بالا نداشته است (Wyss et al., 1999). در صورتی که در منابع دیگر به تغییر خصوصیات بیوشیمیایی، پایداری آنزیم و نقطه ایزوالکتریک اشاره شده است (Konietzny and Greiner, 2002). اساساً به خاطر تفاوت در گلیکوزیله شدن، میانگین وزن مولکولی فیتازهای باکتریایی کوچکتر از فیتازهای قارچی (55-40 در مقابل 120-80 کیلودالتون) است (Choi et al., 2001; Golovan et al., 2000; Kerovuo et al., 1998). افزوده شدن قند به ساختار آنزیم باعث افزایش وزن مولکولی می‏شود. وزن مولکولی فیتازهای گیاهی جدا شده از ذرت، گندم و جو بین 47 تا 76 کیلودالتون است (Konietzny and Greiner, 2002). دو نمونه متفاوت از فیتازها با اندازه کاملاً متفاوت در K. aerogenes گزارش شده است که یکی از آنها با اندازه 700 کیلودالتون (بزرگترین) به صورت آنزیم طبیعی و دیگری با اندازه بسیار کوچک (کوچکترین) که احتمالاً بخشی از یک آنزیم طبیعی است ولی دارای فعالیت کامل می‏باشد (Tambe et al., 1994).

2- دما و pH بهینه

اغلب فیتازها دارای دمای بهینه 60-44 درجه سانتیگراد هستند. اما فیتازهایی با دمای بهینه خارج از این محدوده نیز جداسازی شده‏اند. به طور مثال فیتازهای A. fumigatus و B. amyloliquefaciens دارای دمای بهینه 70 درجه سانتیگراد می‏باشند، در حالی که فیتاز Aerobacter aerogenes دارای دمای بهینه 25 درجه سانتیگراد می‏باشد (Vohra and Satyanaryana, 2003). دمای بهینه فیتاز قارچی بین 60-50 درجه سانتیگراد می‏باشد این در حالی است که فیتازهای مخمری دارای دمای بهینه بالاتر از 60 تا 75 درجه سانتیگراد می‏باشند (Lei et al., 2007). عموماً فیتازهای گیاهی در مقایسه با فیتازهای میکروبی دارای دمای بهینه پایین تری هستند و در این میان فیتاز مربوط به غلات دارای کمترین دمای بهینه اند (Konietzny and Greiner, 2002). نکته قابل تامل در مورد دمای بهینه آنزیم‏های فیتاز این است که اگر چه اغلب میکروارگانیسم ها مزوفیل می‏باشند ولی آنزیم فیتاز آنها دارای بهینه دمایی ترموفیل می‏باشد (Vohra and Satyanarayana, 2003). برای استفاده فیتاز در جیره غذایی دام پایداری آن به دماهای بالا (تحمل دمای 100-80 درجه سانتیگراد) یکی از ویژگی‏های بارز می‏باشد. فیتازهای قلیایی با منشا باسیلوسی کاملاً در دماهای بالا از محدوده 95-80 درجه سانتیگراد پایدارند (Kim et al., 1998; Choi et al., 2001). در حالی که سایر فیتازها در دمای بالای 60 درجه سانتیگراد غیر فعال می‏شوند. به طور کلی آنزیم فیتاز با منشاء میکروبی در مقایسه با فیتازهای گیاهی در محدوده بیشتری از pH و دماهای بالا فعالیت دارند. pH و دمای بهینه فیتازهای گیاهی 6-5/4 و 55-38 می‏باشد (Lei et al., 2007). فعالیت ویژه و تحمل به دمای بالای فیتازهای گیاهی نیز در مقایسه با فیتازهای میکروبی کمتر می‏باشد. مقاومترین فیتاز شناخته شده به دماهای بالا که تا کنون گزارش شده است مربوط به A. fumigatus می‏باشد که قرار دادن آنزیم به مدت 20 دقیقه در دمای 90 درجه سانتیگراد تنها 10 درصد از فعالیت اولیه آن را می‏کاهد (Pasamontes et al., 1997). در مورد فیتازها با این که pH بهینه لحاظ می‏شود ولیکن وقتی این آنزیم در معرض pH های دیگر قرار می‏گیرد آنزیم پایداری خود را حفظ کرده و فعالیت آن قابل برگشت می‏باشد. حساسیت فیتازها به دما بیشتر بوده و در دماهای بالا وقتی واسرشته می‏شوند به حالت اول خود باز نمی‏گردند. اما در این میان برخی از فیتازها به عنوان نمونه A. fumigatus بعد از واسرشتگی دوباره کنفورماسیون فعال خود را باز یافته و به شکل آنزیم طبیعی اولیه در می‏آیند (Vohra and Satyanarayana, 2003).

3- واکنش به سوبسترای خاص

ویژه بودن نسبت به یک سوبسترا[17] و سازگاری[18] به یک سوبسترای خاص از ویژگی‏های مهم فیتازها به حساب می‏آید به طوری که BPP در مقایسه با HAP ها بر محدوده بسیار کوچکی از سوبستراها اثر می‏گذارند و بر سایر سوبستراها فعالیت آنزیمی‏نشان نمی‏دهند. جدیداً ساختار کریستالی[19] فیتاز با منشاء B. amyloliquefaciens نشان داده است که جایگاه فعال دارای بار منفی، محیط الکتروستاتیکی مناسبی را برای کمپلکس دارای بار مثبت کلسیم-فیتات فراهم می‏کند (Ha et al., 2000; Oh et al., 2004). در E. coli ساختار کریستالی فیتاز نشان می‏دهد که تمام گروه‏های فسفات مولکول فیتات با پاکت[20] جایگاه فعال دارای بار منفی واکنش دارند و جایگاه فعال بزرگ این آنزیم شرایط را برای هیدرولیز سایر استرهای فسفات از قبیل pNPP، AMP، ATP، گلوکز 6- فسفات و فروکتوز 1و 6-دی فسفات فراهم می‏کند (Oh et al., 2004).

4- فعالیت ویژه

فعالیت ویژه طبق تعریف به مقداری از آنزیم گفته می‏شود که در دمای 37 درجه سانتیگراد و pH (5 یا 5/5) قادر به آزادسازی 1 میکرومول فسفات معدنی از سوبسترای فیتات سدیم (5 میلی مولار) باشد (Greiner, 2004). طبیعی است که این تعریف در رابطه با فیتازهای اسیدی صادق می‏باشد که در این pH فعالیت دارند و در مورد فیتازهای قلیایی pH بایستی در محدوده 7 رعایت شود. برای نشان دادن فعالیت ویژه از واحدهای U/mg، U/g و U/kg استفاده شده است. در صورت کسر عباراتی چون FTU، PPU، FTY نیز استفاده می‏شود (Anonymous, 2010; Anonymous, 2009). فعالیت ویژه یکی از عوامل کلیدی در کاربردی بودن آنزیم در بعد تجاری می‏باشد. فعالیت ویژه فیتازهای شناخته شده تا کنون از کمتر از U/mg 10 تا بیشتر از U/mg 1000 گزارش شده است به شکلی که بیشترین مقدار آن در Yersinia intermedia، Citrobacter braakii و Peniophora lycii مشاهده شده است. بیشترین فعالیت ویژه گزارش شده مربوط به Yersinia intermedia به میزان U/mg 3960 و Citrobacter braakii به مقدار U/mg 3457 بوده است. فعالیت ویژه فیتازها گیاهی از  U/mg43 تا 636  گزارش شده است (Lei et al., 2007).

5- ثابت های بیوشیمیایی

مقادیر Km فیتازها از Mµ650-10 گزارش شده است و kcat آنها از کمتر از 10 تا  S^-11744 می‏باشد. بیشترین مقادیر kcat/Km، که بیانگر بازده کاتالیتیک آنزیم است مربوط به E. coli و Citrobacter brakii می‏باشد و به ترتیب برابر m^-1s^-110⁷ ×34/1 و m^-1s^-110⁷ × 03/1 است (Konietzny and Greiner, 2002; 2004). از نظر سینتیک تفاوت زیادی در بین فیتازهای گیاهی هست به شکلی که Km از Mµ30 تا 300 و kcat ازS^-1  43 تا 704 متغیر می‏باشد (Lei et al., 2007).

6- رفتار فیتازها در حضور یون‏ها و معرف‏های مختلف

فیتازهای مختلف از نظر نیاز به یون‏ها برای فعالیت خود رفتار متفاوتی نشان می‏دهند. ولی دلیل اثر بازدارندگی برخی از این یون‏ها بر روی فعالیت آنزیم را مربوط به اتصال یون به آنزیم یا تشکیل کمپلکس نسبتاً نامحلول یون- فیتات می‏توان دانست. ولی به هر حال ظهور رسوب به هنگام افزودن Fe²⁺یا Fe³⁺ به مخلوط سنجش، این نظریه را تقویت می‏بخشد که کاهش غلظت سوبسترای فعال به دلیل تشکیل کمپلکس کم محلول یون- فیتات می‏باشد (Konietzny et al., 1995). فعالیت اغلب آنزیم‏های تجزیه کننده فیتات که تا کنون شناسایی شده‏اند در حضور یون‏های روی و مس متوقف می‏شود (Konietzny and Greiner, 2002). در اغلب فیتازها به (جز فیتازهای BPP) حضور یون‏ها در غلظت 5 میلی مولار معمولاً باعث کاهش یا توقف فعالیت آنزیم می‏شود. به جز آنزیم فیتاز A. fumigatus که در حضور EDTA فعالیتش تا 50 درصد افزایش می‏یابد، EDTA اثر چندانی بر روی سایر فیتازهای اسیدی ندارد (Wyss et al., 1999). این در حالی است که فعالیت فیتازهای قلیایی، به عنوان نمونه فیتاز Bacillus sp. DS11 شدیداً در حضور EDTA متوقف می‏شود (Kim et al., 1998; Kerovou et al., 1998) و این بیانگر آن است که یون فلزی برای فعالیت بهینه این گروه از آنزیم‏ها ضروری است. فعالیت آنزیمی فیتازهای جنس باسیلوس به یون Ca²⁺ وابسته است و می‏توان نتیجه‏گیری نمود که آنزیم یون را برای کونفورمیشن فعال[21] خود نیاز دارد (Kerovou et al., 2000).

فلوراید به عنوان یک بازدارنده شناخته شده در مورد اسید فسفاتازها، همچنین اثر بازدارنده رقابتی بر روی چندین فیتاز اسیدی باکتریایی، قارچی و گیاهی دارد. غلظت‏های بازدارنده از یون فلوراید در محدوده 1/0 تا 5/0 میلی مولار گزارش شده است. در مقابل، آنزیم‏های قلیایی تجزیه کننده فیتات از B. amyloliquefaciens و B. subtilisدر حضور این ماده هیچ گونه کاهش فعالیتی از خود نشان ندادند (Konietzny and Greiner, 2002). علاوه بر محصول حاصل از هیدرولیز فیتات یعنی یون فسفات، فیتات نیز می‏تواند اثر بازدارنده بر روی فعالیت آنزیم داشته باشد. غلظت بازدارنده سوبسترا با توجه به نوع فیتاز بین µM 300 (فیتاز ذرت) تا mM20 (فیتاز سویا) گزارش شده است. یون‏های مولیبدات، وانادات و ولفرامات[22] نیز به عنوان بازدارندگان آنزیم فیتاز شناخته می‏شوند (Konietzny and Greiner, 2002).

گروه‏بندی فیتازها

فیتات بایستی توسط آنزیم فیتاز شکسته شود تا منابع فسفر آن برای گیاهان، باکتری‏ها و جانوران قابل استفاده باشد. تمرکز بر روی ویژگی‏ها و خصوصیات فیتازهای شناسایی شده تا به حال این نکته را بر ما روشن می‌کند که طبیعت تنها یک سازوکار برای رهاسازی گروه‏های فسفات در همه موجودات قرار نداده است (Mullaney and Ullah, 2005). ممکن است تقسیم‌بندیهای مختلف در رابطه با فیتازها مشاهد شود. برخی از آنها بر اساس مکان استقرار و عمل این آنزیم می‏باشد. به عنوان نمونه برخی از فیتازها، فیتاز برون سلولی بوده که غالباً در قارچ‏ها و باکتری‏های جنس Bacillus و Enterobacter دیده می‌شوند. برخی از فیتازها درون سلولی بوده و برخی هم متصل به دیواره سلولی هستند که از این گروه می‌توان فیتاز E. coli و Kelbsiella را نام برد. معمولاً فیتازهای باکتری‏های گِرَم منفی درون سلولی بوده در حالی که فیتازهای باکتری‏های گِرَم مثبت و قارچ‏ها برون ‌سلولی هستند (Kim et al., 1998; Konietzny and Greiner, 2002; Shimizu, 1992; Oh et al., 2004; Vohra and Satyanaryana, 2003). مطالعات نشان داده که سویه‌های A. niger بهترین تولیدکنندگان فیتاز برون سلولی هستند.

فیتازها را بر اساس pH بهینه فعالیت نیز به دو گروه کلی فیتازهای اسیدی و قلیایی تقسیم‌بندی می‏کنند. از گروه اول می‌توان به فیتازهای قارچی و گروه باکتری‏های گِرَم منفی اشاره کرد که در pH های اسیدی (5/3 تا 6) فعالند. باکتری‏های جنس Bacillus معمولاً فیتازهای قلیایی دارند (Vohra and Satyanaryana, 2003; Oh et al., 2004). تقریباً همه فیتازها یک pH بهینه مشخص دارند اما فیتاز A. fumigatus یک استثناء است که در محدوده وسیعی از pH (3/7-4) با فعالیت نسبی 80 درصد فعال می‏باشد (Greiner and Konietzny, 2006; Lei and stahl, 2001). با توجه به نقش فیتازها در تغذیه دام و اینکه این آنزیم بایستی درون سیستم گوارشی با pH اسیدی حاکم بر آن فعال باشد، غالب تحقیقات بر روی فسفاتازهای اسیدی متمرکز است.

در یک تقسیم‌بندی دیگر، فیتازها را براساس این که کدام گروه از فسفات ابتدا توسط آنزیم از فیتات برداشته می‌شود نام گذاری می‏کنند. به طور مثال، 3- فیتاز 5- فیتاز یا 6- فیتاز که به ترتیب بیانگر آن است که فسفات شماره 3، 5 و فسفات شماره 6 اولین فسفات های برداشته شده از مولکول فیتات می‏باشند. فیتازهای میکروبی به ویژه نمونه قارچی A. niger و باسیلوس ها اغلب گروه فسفات را از روی کربن شماره 1 یا 3 حلقه اینوزیتول برمی‏دارند و جزء 3- فیتازها به حساب می‏آیند اما فیتازهای گیاهی از نوع 6- فیتازند. البته باید در نظر داشت که فیتاز E. coli و فیتازهای قارچی بازیدیومیست‏ها (Peniophora lycii) استثناست و از نوع 6- فیتازند (Vohra and Satyanaryana, 2003; Cao et al., 2007; Oh et al., 2004; Vats and Banerjee, 2004; Lei and Porres, 2003).

از نظر الگوی بیان، فیتازهای طبیعی را به فیتازهای دایمی[23] و القایی[24] تفکیک می‏کنند (Vohra and Satyanaryana, 2003). شیعه و همکاران مشاهده کردند که تولید فیتاز برون سلولی قارچی در غلظت‏های پایین فسفات معدنی[25] در محیط رشد القاء می‌شود، برخلاف فیتاز قارچی، فیتاز B. subtilis در حضور فیتات القاء می‌شود همچنین این آنزیم در حضور عصاره آرد گندم نیز که حاوی فیتات می‏باشد القا می‌گردد (به نقل از Kerovuo, 2000). در حالی که در E. coli وقتی رشد باکتری وارد مرحله سکون یا توقف می‏شود و شرایط بی هوازی حاکم می‏شود تولید آنزیم فیتاز طبیعی تحریک می‏شود (Konietzny and Greiner, 2002). مشاهده رفتار افزایش تولید فیتاز در نمونه‏های میکروبی مختلف در انتهای دوره رشد این نظریه را تقویت می‏کند که محدودیت انرژی و کربن در اواخر دوره رشد تولید آنزیم را زیاد می‏کند.

‏          تا کنون چهار گروه مختلف فیتاز بر اساس توالی ژن‏ها و مناطق حفاظت شده، ساختمان سه بعدی، سازوکار‌های واکنش و ویژگی‏های آنزیمی شناخته شده است. چهار گروه عبارتند از Histidine Acid Phosphatase (HAP) ، B-Propeller Phytase (BPP) ، Cystein Phosphatase (CP) و Purple Acid Phosphatase (PAP) (Mullaney and Ullah, 2005; Tang et al., 2006). ویژگی‏های بیوشیمیایی فیتازهای شناخته شده از منابع مختلف در جدول 1 خلاصه شده است.

الف- هیستیدین اسید فسفاتاز (HAP)

اغلب فیتازهای باکتریایی، قارچی و گیاهی متعلق به این گروه می‏باشند (Oh et al., 2004) و بیشتر مطالعات بر روی فیتازها به این گروه تعلق دارد. موتیف RHGXRXP در جایگاه فعال آنزیم می‏باشد که در بین همه اعضا این گروه حفظ شده است (Oh et al., 2004). فیتازهای متعلق به گروه هیستیدین اسید فسفاتازها آنهایی هستند که گستردگی بیشتری داشته و بیشتر مورد استفاده بوده‏‌اند. این گروه در بین گیاهان، جانوران و ریزسازواره‌ها پراکندگی دارند (Wodzinki and Ullah, 1996). دلیل نامگذاری هیستیدین اسید فسفاتازها به خاطر وجود اسیدآمینه هیستیدین در دو منطقه حفاظت شده از توالی آنها ‌می‏باشد و در  pH اسیدی فعالیت دارند. یکی توالی حفاظت شده RHGXRXP که نزدیک انتهای N[26] و دیگری HD که نزدیک به انتهای C[27] می‏باشد (Van Etten, 1982). بار مثبت آرژنین در موتیف RHGXRXP مسئول تشخیص و درگیر شدن با بار منفی گروه‏های فسفات می‏باشد و HD دهنده پروتون برای گروه ترک کننده سوبسترا است (Vohra and Satyanaryana, 2003). با آرایش مناسب اسیدهای آمینه، نحوه قرارگیری دو موتیف فوق‏الذکر به صورتی خواهد بود که یک جایگاه فعال را تشکیل می‏دهد که می‏تواند در یک واکنش دو مرحله‏ای فسفومنواسترها را هیدرولیز نماید. مولکول فیتات شدیداً دارای بار منفی است و برای اینکه با جایگاه فعال آنزیم درگیر شود این جایگاه در pH اسیدی دارای بار مثبت خواهد بود تا بتواند فیتات را هیدرولیز نماید (Lei et  al., 2007 ). بر خلاف BPP، HAPها قادر به هیدرولیز کمپلکس فلز-فیتات به خاطر دافعه بین بار مثبت جایگاه فعال و بار مثبت کمپلکس فیتات-فلز نمی‏باشند.

          فیتازهای این گروه به جز در توالی‌هایی که مربوط به جایگاه فعال آنزیم می‏باشد تشابه چندانی با هم ندارند. فیتاز E. coli از جمله HAP یا HAPhy شناخته شده در بین پروکاریوت ها می‏باشد (Greiner et al., 1993). از جمله فیتازهای یوکاریوتی این گروه می‌توان به فیتاز A. niger اشاره کرد (Vats and Banerjee, 2005). اغلب فیتازهای قارچی مطالعه شده مربوط به دو گونه A. niger وA. fumigatum  می‏باشد. مطالعات نشان می‏دهد که دو زیرگروه از HAPhy وجود دارد، زیرگروهی که برتعداد زیادی از سوبستراها اثر داشته اما فعالیت ویژه اندکی بر روی اسید‌فیتیک دارد، در مقابل زیرگروه دیگر فعالیت ویژه بالایی در حضور اسید فیتیک داشته اما بر تعداد کمتری از سوبستراها تاثیرگذار می‏باشد. این دسته از آنزیم‏ها توانایی جداسازی 5 گروه فسفات متصل به فیتات را دارند و ماده نهایی حاصل هیدرولیز این گروه از آنزیم‏ها اینوزیتول مونوفسفات[28] می‏باشد (Oh et al., 2004). غالب فیتازهای شناخته شده تا کنون قادر به رهاسازی 3 یا 5 گروه فسفات از مولکول فیتات می‏باشند، این در حالی است که اخیراً برخی از فیتازها از باکتریها جداسازی شده‏اند که تنها یک گروه از فسفات را آزاد می‏کنند (Greiner, 2004).

Phytate                               IP +5Pi

Phytate                               IP5 + Pi

Oh et al (2004) گروه ‌HAP را بر اساس مشابهت توالی آمینواسیدی و خصوصیات بیوشیمیایی از قبیل pH و ویژگی آزادسازی اولین فسفر فیتات (position-specificity of phytate hydrolysis) به 3 زیرگروه PhyA، PhyB وPhyC تقسیم‌بندی کردند:

گروه PhyA شامل آنزیم‏هایی برون سلولی با 465 و 469 آمینواسید از A. niger، A. fumigatus، A. terrus، Emericella nidulans، Myceliophthora thermophila و Talaromyces thermophilus می‏باشد. این فیتازها دارای دو pH بهینه فعالیت یعنی 5/2 و 5 و دمای بهینه 55-60 درجه سانتیگراد هستند و بین دو نقطه pH فعالیت آنزیم افت پیدا می‏کند. این گروه از فیتازها در شرایط غیرگلیکوزیله دارای وزن مولکولیkDa 50-48 و در صورت گلیکوزیله شدن دارای وزن مولکولی kDa128-62 می‏باشند که از طریق SDS-PAGE مشخص شده است. این گروه جزء 3-فیتازها می‏باشند  (Vohra and Satyanaryana, 2003; Oh et al., 2004).

گروه PhyB دربرگیرنده فیتازهای برون سلولی از A. niger، Saccharomyces cervisiae و Schizosaccharomyces pombe است. دارای 453-479 آمینواسید با وزن مولکولی 50-48 کیلودالتون می‏باشند و در صورت گیکوزیله شدن وزن مولکولی آنها با روش SDS-PAGE تا 65 کیلودالتون تخمین زده شده است. این فیتازها دارای pH بهینه یعنی 5/2 هستند و در pH 5 فاقد فعالیت هستند. از مهمترین عضو این گروه فیتاز A. niger می‏باشد که به شکل 4 واحدی[29] می‏باشد بر خلاف اغلب فیتازها که تک واحدی هستند. گروه B فیتازها همانند گروه A بر دامنه وسیعی از سوبستراها اثر گذاشته و دمای بهینه فعالیت آن 60-55 درجه سانتیگراد بوده و از نوع آنزیم 3-فیتاز هستند (Vohra and Satyanaryana, 2003; Oh et al., 2004).

گروه PhyC دربرگیرنده فیتازهای درون سلولی با 439-354 آمینواسید و با وزن مولکولی 45-42 کیلودالتون هستند. این گروه از آنزیم‏ها در E. coli، موش و انسان (اسیدفسفاتازهای پروستاتیک) گزارش شده است. دمای بهینه فعالیت آن 60-40 درجه سانتیگراد و pH بهینه آن 6-5 می‏باشد. این گروه هم بر تعداد زیادی از ترکیبات فسفریله اثرگذار بوده و بر خلاف دو گروه قبلی که 3- فیتاز هستند، نوع آنزیم آن 6-فیتاز می‏باشد (Oh et al., 2004).

ب- بتا پروپلر فیتاز (BPP)

دلیل این نام ساختار سه بعدی مولکول‏های این دسته است که یک شکل پره‏ای[30] با شش تیغه را نشان می‏دهد (شکل 2). این گروه از فیتازها در جنس Bacillus از باکتری‏ها و برخی از گیاهان مشاهده شده است و گروهی از فیتازها را شامل می‌شود که برای فعالیت و پایداری خود به کلسیم (Ca²⁺) نیاز دارند. زیرا یون کلسیم اتصال فیتات به آنزیم را با ایجاد محیط الکتروستاتیک مساعد تسهیل می‏کند. فقدان توالی موتیف[31] RHGXRXP در این گروه باعث شده است که این گروه را عضوی از گروه فیتازهای HAP ندانند (Kim et al., 1998; Shin et al., 2001; Ha et al., 2000). دو ویژگی بارز این گروه فعالیت وابسته به فلز[32] و افزایش پایداری آنها در حضور کاتیون فلزی است (Lei and Porres, 2003; Lei et al., 2007; Shin et al., 2001). دو جزء در سازوکار کاتالیتیکی BPP ها درگیر می‏باشد، یکی جایگاه تمایل جذبی[33] که سوبسترا را جذب می‏کند و دیگری جزء مجاور آن که مکان برش[34] در هیدرولیز گروه فسفات می‏باشد. به این ترتیب دو مولکول فسفات در مجاورت هم یکی در جایگاه تمایل جذبی و دیگری در جایگاه هیدرولیز قرار می‏گیرد و تنها یکی از آنها از سوبسترا برداشته می‏شود. به این خاطر این آنزیم‏ها تنها 3 گروه فسفات از 6 گروه فسفات مولکول فیتات را آزاد می‏کنند (Lei et al., 2007). BPPها از نظر pH بهینه، در محدوده خنثی یا بازی فعالیت دارند و بر تعداد محدودی از سوبستراها اثر می‌گذارند. آنها برای فعالیت خود کلسیم نیاز داشته و تنها 3 فسفات از 6 فسفات موجود در مولکول فیتات را آزاد می‌کند. در نتیجه، اینوزیتول تری‌فسفات به عنوان ماده نهایی عمل هیدرولیز آنزیم فیتاز محسوب می‌شود. با توجه به pH بهینه فعالیت، این گروه به نام فیتازهای قلیایی[35] هم شناخته می‌شوند (Oh et al., 2004).

Ca-Phytate                                 IP3 + 3Pi

Oh et al (2004) گروه BPP را با نام PhyD در مقاله خود مورد بحث قرار داده‌اند. این فیتازها پروتئین‏های برون سلولی را شامل می‌شوند که وزن مولکولی تقریبی آنها 42 کیلو دالتون می‏باشد. دما و pH بهینه آنها به ترتیب 70-55 درجه سانتیگراد و 8-7 می‏باشد. این گروه بر روی سوبستراهای معمول HAPها قدرت هیدرولیز کمی‏داشته و بر فیتات کلسیم (و نه فیتات تنها) اثرگذار بوده و از نوع آنزیم‏های 3-فیتاز می‏باشند.

شکل 2- نمایشی از ساختار مولکولی بتا پروپلر فیتازها (Ha et al., 2000).

Figure 2- Molecular structure of BPP (Ha et al., 2000).

ج- اسید فسفاتاز بنفش (PAP)

این گروه از متالوآنزیم‏ها یا متالوفسفواسترازها[36] در برخی از گیاهان، باکتری‏ها، قارچ‏ها و جانوران وجود دارند. همه اعضای این خانواده دارای هفت اسیدآمینه (D, D, Y, N, H, H, H) پیوند یابنده[37] با فلز در یک آرایش خاص می‏باشند. نتیجه همردیفی توالی آمینواسیدهای پروتیئن‌های فیتازی این گروه نشان می‏دهد که موتیف DXG..GDXXY..GNH(E,D))VXXH..GHXH. در آنها حفظ شده است (Mullaney and Ullah, 2005; Olczak et al., 2003) و این اسیدهای آمینه در پنج موتیف حفاظت شده (DxG/GDx₂Y/GNH(E,D) /Vx₂H/GHxH) قرار دارند. PAPهای جانوری دارای مرکز دو هسته‌ای فلزی[38] می‏باشد که از دو آهن تشکیل شده است در حالی که در PAPهای گیاهی یکی از آهن‌ها با یون Zn²⁺ یا Mn²⁺ جایگزین شده است. مرکز دو هسته فلزی به صورت Fe(III) -Me(II) می‏باشد که در آن Me می‏تواند Fe²⁺، Mn²⁺ یا Zn²⁺ باشد. در گیاهان دو گروه از PAPها قابل تشخیص‌اند، PAPهای کوچک که به صورت مونومر هستند با وزن مولکولی حدود 35 کیلودالتون وPAPهای بزرگ که به صورت دایمر هستند و هر جزء وزن مولکولی 55 کیلو دالتون دارد (Olczak et al., 2003; Lei et al., 2007). فعالیت فیتازی برای برخی از اعضاء این خانواده در گیاهان سویا و برنج گزارش شده است و بررسی فیتاز موجود در جوانه‌های در حال رشد بذور سویا (GmPhy) نشان داد که فعالیت ویژه آن در مقایسه با فیتازهای قارچی پایین‌تر است و هیدرولیز آهسته و متعادل فیتات در بذرهای گیاهان شاید در فرایند جوانه‌زنی آنها کارامدتر باشد (Mullaney and Ullah, 2005).

د- سیستئین فسفاتاز (CP)

فرض بر این است که حضور میکروارگانیسم ‏در سیستم گوارشی نشخوارکنندگان باید دلیلی بر توانایی استفاده آنها از فیتات باشد و این در حالی است که تک معده‏ایها قادر به این امر نیستند. اخیراً گروه دیگری از فیتازها از باکتری بی‌هوازی روده‌ای به نام Selenomonas ruminntium گزارش شده است (Tang et al., 2006; Lei et al., 2007; Mullaney and Ullah, 2005). دما و  pH بهینه برای فعالیت این آنزیم تک واحدی با وزن 46 کیلودالتون به ترتیب 55-50 درجه سانتیگراد و 5/5-4 می‏باشد. کاتیون سرب اثر افزاینده بر فعالیت این آنزیم داشته در حالی که کاتیون‏های Fe²⁺، Fe³⁺، Hg²⁺ و Zn²⁺ به شدت اثر بازدارنده بر فعالیت آنزیم دارند. مطالعات همردیفی توالی این ژن، تشابه آن را با سیستئین فسفاتاز نشان می‏دهد. مشابهت توالی آن با توالی جایگاه فعال پروتئین تیروزین فسفاتاز (PTP)، یعنی موتیف HCXXGXXR(T/S) می‏باشد. این آنزیم همانند HAPها قادر به جداسازی 5 گروه فسفات از فیتات می‏باشد. جایگاه فعال این آنزیم لوپی[39] را تشکیل می‏دهد که همانند پاکت PTPها محلی برای اتصال سوبسترا عمل می‏کند. عمق این پاکت بسیار مهم می‏باشد زیرا واکنش به سوبستراهای مختلف به آن مربوط می‏شود. پاکت پهن و عمیق CPhy باکتری S. ruminntium در مقایسه با PTP و همچنین حضور محیط الکتروستاتیک مناسب باعث می‏شود تا این فیتاز بر سوبسترای فیتات و دیگر ترکیبات فسفریله موثر واقع شود (Lei et al., 2007).

کاربرد فیتازها

الف- در تغذیه دام و جیره غذایی

جانوران تک معده‌ای از قبیل خوک، طیور و ماهی به دلیل فقدان فیتاز در داخل سیستم گوارشی خود قادر به استفاده از فیتات موجود در جیره غذایی خود نمی‏باشند. بنابراین برای تامین فسفات معدنی مورد نیاز آنزیم فیتاز به جیره آنها افزوده می‌شود. به نظر می‌رسد که میکروفلور تولیدکننده فیتاز در روده بزرگ آنها واقع شده که با فرض آزادسازی فسفات هم چندان قابلیت جذب در این مکان برای آن فراهم نمی‌شود. باید در نظر داشت که فیتات به خاطر قابلیت داشتن 12 بار منفی در مولکول خود می‌تواند کاتیون‏های فلزی مختلف و همچنین پروتئین‏ها را با توجه به pI آنها جذب نموده و بدین صورت در انحلال و جذب آنها اختلال ایجاد نماید. بدین خاطر فیتاز در جیره غذایی این گروه از جانوران تلفیق می‌شود تا فراهمی فسفر و عناصر معدنی، آمینواسیدها و انرژی را بهبود بخشد. به خدمت گرفتن آنزیم‏های فیتاز در سال 1990 به دنبال جرایمی‏سنگینی که برای تولیدکنندگان و پرورش دهندگان خوک و طیور در نتیجه آلودگی فسفات در مناطقی که تولید گسترده‏ای داشتند، آغاز شد. در این رابطه گروهی از فیتازها با نام تجاری Finase، Natuphos، Allzyme و Bio-Feed (جدول 2) از منابع میکروبی تولیدکننده فیتاز که غالب آن از قارچ آسپرژیلوس ‌می‏باشد تولید و مورد استفاده قرار گرفته‌اند و توانسته‌اند 25 تا50 درصد هدر رفت فسفر را کاهش دهند (Haefner et al., 2005; Kerovuo, 2000; Vohra and Satyanarayana, 2003; Selle et al., 2002; Selle and Ravindran, 2007). فیتاز‌هایی که به جیره غذایی طیور و آبزیان اضافه می‌شوند باید دارای فعالیت ویژه بالا، موثر بر سوبستراهای مختلف، فعال در محدوده وسیعی از pH، پایداری خوب در زمان نگهداری و انجام فرایند تهیه‌سازی جیره غذایی[40] باشند که معمولاً دمای این فرایند بین 65 تا 90 درجه سانتیگراد متغیر می‏باشد و به منظور حذف آلودگیهای Salmonella انجام می‏گیرد (Konietzny and Greiner, 2002; Lei et al., 2007).

اولین آزمایش در این زمینه به بیش از 40 سال پیش برمی‏گردد، زمانی که نلسون و همکارانش در آزمایش مقدماتی خود فیتاز استخراجی از A. ficcum را در جیره غذایی به کار بردند و اینگونه نتیجه گرفتند که هزینه تمام شده برای آنزیم کاربردی بسیار گران بوده و نمی‏توان در جیره غذایی استفده نمود (Nelson et al., 1968). جیره غذایی طیور g/Kg 5/2 تا 4 فسفر به شکل فیتات دارا می‏باشد. نکته قابل توجه آن است که زمان کم حضور فیتات در سیستم گوارشی پرندگان و همچنین محدودیت pH حاکم در سیستم گوارشی آنها، اجازه تجزیه کامل را به آن نخواهد داد و فیتازهای افزودنی تنها قادر به تجزیه 35 درصد فیتات خواهند بود (Selle and Ravindarn, 2007). در خوکها استفاده از فیتاز به میزان U/Kg 750 به همراه ذرت فراهمی فسفر را از 18 درصد تا 56 درصد افزایش داد این در حالی بود که موقع افزودن به گندم میزان افزایش 62 تا 74 درصد و در مورد چاودار 52 تا 67 درصد گزارش شده است (Lei et al., 2007). ارزش معادل فسفر برای فیتاز استفاده شده گر چه متغیر است و به سن دام، نوع خوراک و غیره بستگی دارد ولی به صورت تقریب FTU/Kg 840 معادل  g/Kg1 فسفر می‏باشد (Selle and Ravindarn, 2007). آزمایشات متعدد مزرعه ای و آزمایشگاهی نشان داده است که استفاده از 500 تا 1000 واحد آنزیم فیتاز می‏تواند جایگزین 1 گرم فسفات معدنی در جیر ه غذایی دام شود و ضایعات فسفر کل را 30 تا 50 درصد کاهش دهد (Lei and Porres, 2003). علاوه بر استفاده مستقیم آنزیم فیتاز، میکروب تولید کننده فیتاز را نیز به شکل پروبیوتیک می‏توان به جیره غذایی اضافه نمود. بر اساس تعریفی که FAO/WHO برای واژه پروبیوتیک[41] ارایه داده است، میکروارگانیسم های زنده‏ای را شامل می‏شود که وقتی به مقدار کافی استفاده می‏شوند مزیت‏هایی برای سلامتی میزبان خود به دنبال دارند. ریزسازواره‏های تولیدکننده فیتاز به شرط اینکه اثرات بیماریزایی بر روی میزبان خود نداشته باشند می‏توانند مستقیماً به جیره غذایی اضافه شوند و به عنوان پروبیوتیک استفاده شوند (Afinah et al., 2010).

ب- کاربرد غذایی و تغذیه ‏انسان

تا کنون هیچ محصول فیتاز به منظور کاربرد و استفاده در بخش تغذیه‌ای انسان وارد بازار نشده است. در غذاهای تهیه شده از غلات و حبوبات که میزان بالایی از فیتات را به همراه خود دارند، مصرف روزانه فیتات‏ها  ممکن است تا 5/4 گرم برسد، اسید فیتیک نقش بازدارنده خود را در جذب عناصر معدنی از قبیل آهن، روی، مس، کلسیم، منگنز و منیزیم بازی کرده و کمبود آهن در زنان باردار و گیاهخواران در کشورهای در حال توسعه شایع است و شاهد کمبود روی و آهن ناشی از زیادی فیتات در جیره غذایی هستیم. بخشی از اثرات منفی حضور فیتات در جیره غذایی بدون حضور فیتاز در قسمت فوق آورده شده است (Haefner et al., 2005; Kerovuo, 2000; Lei and Porres, 2003; Greiner and Konietzny, 2006; Vohra and Satyanarayana, 2003). ریزسازواره‏های بی خطر برای انسان از قبیل Sachromyces ، Lactobacillus و Bifidobacterium که سالم بودن محصولات جانبی آنها از مدتها قبل برای دام و انسان مشخص شده است می‏تواند در کاهش میزان فیتات غذای انسان کاربرد داشته باشد ولی فعالیت فیتازی بالا از هیچ یک از آنها مشاهده نشده است. در صورت مشاهده چنین موردی می‏توان آنزیم حاصل را بدون خالص سازی مستقیماً در جیره غذایی انسان استفاده کرد (Greiner and Konietzny, 2006). همچنین برای رفع مشکل فعالیت فیتازی پایین سویه‏های نامبرده از طریق انتقال ژن فیتاز از سایر منابع میکروبی به این سویه‏ها (از قبیل S. cervisia و Pichia pastoris) می‏توان اقدام به تولید فیتاز نوترکیب نمود (Lei and Porres, 2003). علی رغم بهبود فراهمی زیستی عناصر معدنی و ریزمغذی‏ها، افزودن فیتاز در خلال تهیه مواد غذایی (مثلاً پخت نان) بر کیفیت و عملکرد آن و بهینه شدن از نظر اقتصادی تاثیرگذار است. ذکر این نکته ضروری است که فیتات در کنار مضراتش دارای مزایایی از قبیل جلوگیری از تشکیل سنگ کلیه، بیماریهای قلبی و سرطان می‏باشد (Greiner and Konietzny, 2006).

ج- تهیه مایواینوزیتول فسفات‌ها

مایواینوزیتول (مونو، دی، تری و تترا) فسفات نقش اساسی در فرایند پیام رسانی غشایی[42] و در تحرک کلسیم از بخش ذخیره درون سلولی بافت‏های حیوانی و گیاهی دارد. کاربردهای ویژه ‏اینوزیتول‌های فسفات در درمان بیماری‏ها مانند اثر بازدارنده آن در مقابل عفونت‌های رتروویروسی، بیماریهای تنفسی از قبیل آسم و کاهش بیماریهای قلبی و سرطان و منافع مشابه برای سلامت انسان باعث شده که این گروه از مواد مورد توجه قرار بگیرند (Shamsuddin, 2002). راه معمول تولید این دسته از مواد، استفاده از روش‌های شیمیایی می‏باشد که این روش همراه با مشکلاتی بوده و تحت دماها و فشارهای خیلی بالا رخ می‏دهد. یکی از روش‌های جایگزین، استفاده از آنزیم فیتاز برای تهیه مایواینوزیتول‏ها ست، زیرا در فرایند هیدرولیز فیتات تجزیه مرحله به مرحله آن رخ می‏دهد و شکل ساده هیدرولیز مرحله‌ای آن به صورت زیر خواهد بود (Haefner et al., 2005; Kerovuo, 2000; Vohra and Satyanarayana, 2003; Konietzny and Greiner, 2002).

IP6      IP5        IP4        IP3       IP2        IP

تعداد و توزیع گروههای فسفات بر روی حلقه مایواینوزیتول تعیین‏کننده اثر متابولیکی[43] آنها خواهد بود. برخی از این ترکیبات به ویژه D-myo-inositol (1,4,5) triphosphate و D-myo- inositol (1,3,4,5) tetrakisphosphate به عنوان پیام رسان ثانویه درون سلولی[44] نقش مهمی را ایفا می‏کند (Greiner and Konietzny, 2006). اسید فیتیک و مواد حد واسط اینوزیتول‏ها در درمان بیماریهای پارکینسون، آلزایمر، MS و کاهش کلسترول و تری گلیسریدها کاربرد دارند (Afinah et al., 2010; Greiner and Konietzny, 2006 ).

د- صنعت پالپ[45] و کاغذ

برداشت یا حذف اسید فیتیک در صنعت کاغذ ممکن است مهم باشد. یک آنزیم فیتاز مقاوم به دماهای بالا می‌تواند یک عامل زیستی تازه در تخریب اسید فیتیک باشد. در نتیجه تجزیه آنزیمی‏اسید فیتیک مواد جانبی شدیداً سمی و سرطانزا تولید نخواهد شد. بنابراین استفاده از فیتاز در این صنعت موافق و سازگار با محیط[46] خواهد بود (Kerovuo, 2000).

و- اصلاح‌کننده خاک[47]

در مکان‏های خاص اسیدفیتیک و مشتقات آن ممکن است بیشتر از 50 درصد کل فسفر آلی در خاک را شامل شود. بنابراین استفاده از آنزیم فیتاز به صورت غیر مستقیم از طریق موجودات تولید کننده آن برای رهاسازی فسفات از منبع فیتات و بهبود تغذیه فسفری مد نظر می‏باشد. استفاده از ریزسازواره‏های توانمند در تولید فیتاز یا گیاهان تراریخته حاوی ژن رمز کننده فیتاز بخشی از تحقیقات در این زمینه را به خود اختصاص داده‏اند. استفاده از فیتاز در خاک زیر کشت ذرت، تحریک رشد محصول را در نتیجه تجزیه فیتات به همراه داشت (Vohra and Satyanarayana, 2003). این در حالی است که جورج و همکارانش رفتار آنزیم فیتاز برون سلولی A. niger در گیاه تراریخت Arabidopsis thaliana را تحت شرایط خاک مورد بررسی قرار داده و به غیرفعال شدن این آنزیم در اثر جذب سطحی شدن توسط کلوئیدهای خاک اشاره داشتند (Bunemann, 2008).

ه- تولید پراکسیدازها

یکی از کاربردهای فیتازها تولید پراکسیدازهای نیمه سنتتیک می‏باشد. محققان دریافته اند که HAPها با توالی جایگاه فعال RHGXRXP زمانی که یون وانادات به داخل جایگاه فعال آنها تلفیق می‏شود به عنوان پراکسیداز عمل می‏کنند (Vohra and Satyanarayana, 2003).

دورنمای تحقیقات

مهندسی پروتئین راهی برای بهینه نمودن آنزیم‏ها با توجه به نیاز ما می‏باشد. با مهندسی پروتئین می‏توان دامنه فعالیت آنزیم در محدوده بیشتری از pH، پایداری آنزیم به دماهای بالا و فعالیت ویژه آن را تغییر داد. یکی از راه های بهینه نمودن فیتازها برای مصارف کاربردی استفاده از مهندسی پروتئین برای بالا بردن فعالیت ویژه یا بالا بردن تحمل دمایی آن است. در این راستا با استفاده از مقایسه توالی 13 گونه قارچی، آنزیم فیتاز مصنوعی طراحی شد که دارای تحمل دمایی 26-15 درجه سانتیگراد بیشتر نسبت به توالی های قبلی بود (Lehmann et al., 2000 a, b). از آنجا که مکان اصلی اثرگذاری فیتاز بر روی فیتات معده (pH خوک 5-2 و طیور 5-4) می‏باشد و pH حاکم بر آن اسیدی است، برخی از مطالعات بر روی تغییر pH بهینه فعالیت آنزیم فیتاز، از طریق اصلاح یونیزه شدن گروههایی که مستقیماً در کاتالیز درگیرند، جایگزینی اسیدآمینه‏ای که در جایگاه فعال حضور دارد به شیوه پیوندهای هیدروژنی یا پل های نمکی متمرکز شده است (Lei et al., 2007; Tomschy et al., 2002). مقاومت فیتاز به پروتئازها جنبه دیگری از مطالعات بهینه سازی فیتازها برای مصارف تجاری است. به طور مثال فیتاز A. niger در مقایسه با فیتاز E.coli به پپسین حساستر می‏باشد. مقایسه چهار فیتاز قارچی با فیتاز E. coli و فیتاز  B. subtilis نشان داد که فیتازهای قارچی به پانکراتین و پپسین حساسند در حالی که فیتاز E. coli  در حضور هر دو پایدار بود اما فیتاز B. Subtilis فقط به پانکراتین مقاومت نشان داد (Lei et al., 2007).

ایجاد گیاهان و حیوانات تراریخته که دارای ژن رمزکننده فیتاز می‏باشند به عنوان یکی از راه حل‏های پیش روی محققان برای غلبه بر مشکل تامین فسفات مورد نیاز آنها از منابع فسفات آلی و به ویژه فیتات می‏باشد. در این رهگذر تولید خوک تراریخته با نام EnviroPig که با قابلیت بیان بالای فیتاز باکتری E. coli (appA) در بزاق دهان حیوان می‏باشد کاهش فسفر در مدفوع را تا 75 درصد نشان داده است. تولید گیاهان تراریخته سویا، تنباکو، برنج و ... گزارش شده است (Lei et al., 2007). به نظر می‏رسد در انتقال ژن فیتاز به گیاهان، ژن‏های فیتاز بسیار خاص و ویژه مثل ژن فیتاز باسیلوس نامزد مناسبتری باشد زیرا فیتازی با محدوده عمل وسیع بر سوبستراهای مختلف ممکن است در مسیرهای متابولیکی سلولهای گیاهی اختلال ایجاد نماید (Konietzny and Greiner, 2004).

منابع

Afinah S, Yazid AM, Anis Shobirin MH, Shuhaimi M (2010). Phytase: application in food industry. International Food Research Journal 17: 13-21.

Anonymous (2009). Safety and efficacy of the product Ronozyme® NP (6-phytase). for use as feed additive for poultry, weaned piglets and pigs for fattening (Scientific Opinion). The EFSA Journal 1: 1-20.

Anonymous (2010). Scientific Opinion on the safety and efficacy of Natuphos® (3-phytase). for minor avian species (quails, pheasants, partridges, guinea fowl, geese, pigeons, ostriches, peacocks, flamingos). and ornamental birds (Scientific Opinion). EFSA Journal 8: 1427.

Berka RM, Rey MW, Brown KM, Byun T, Klotz AV (1998). Molecular characterization and expression of a phytase gene from the thermophilic fungus Thermomyces lanuginosus. Applied Environmental Microbiology 64: 4423–4427.

Bunemann EK (2008). Enzyme additions as a tool to assess the potential bioavailability of organically bound nutrients. Soil Biology and Biochemistry 40: 2116-2129.

Casey A, Walsh G (2004). Identification and characterization of a phytase of potential commercial interest. Journal of Biotechnology 110: 313-322.

Cao L, Wang W, Yang C, Yang Y, Diana J, Yakupitiyage A, Luo Z, Dapeng L (2007). Application of microbial phytase in fish feed. Enzyme and Microbial Technology 40: 497-507.

Cho J, Lee C, Kang S, Lee J, Lee H, Bok J, Woo J, Moon Y, Choi Y (2005). Molecular cloning of a phytase gene (phy M). from Pseudomonas syringae MOK1. Current Microbiology 51: 11–15.

Cho JS, Lee CW, Kang SH, Lee JC, Bok JD, Moon YS, Lee HG, Kim SC, Choi YJ (2003). Purification and Characterization of a Phytase from Pseudomonas syringae MOK1. Current Microbiology 47: 290–294.

Choi YM, Suh HJ, Kim JM (2001). Purification and Properties of Extracellular Phytase from Bacillus sp. KHU-10. Journal of Protein Chemistry 20: 287–292.

De Angelis M, Gallo G, Corbo MR, McSweeney PLH, Faccia M, Giovine M, Gobbetti M (2003). Phytase activity in sourdough lactic acid bacteria: purification and characterization of a phytase from Lactobacillus sanfranciscensis CB1. International Journal of Food Microbiology 87: 259–270.

Dvorakova AJ (1998). Phytase: sources, preparation and exploitation. Folia Microbiology 43: 323–338.

Ehrlich KC, Montalbano BG, Mullaney EJ, Dischinger HCJ, Ullah AH J (1993). Identification and cloning of a second phytase gene (phy B). from Aspergillus niger (ficuum). Biochemistry and Biophysic Research Community 195: 53–57.

Golovan S, Wang G, Zhang J, Forsberg CW (2000). Characterization and overproduction of the Escherichia coli appA encoded bifunctional enzyme which exhibits both phytase and acid phosphatase activities. Canadian Journal of Microbiology 46: 59–71.

Greaves MP, Anderson G Webley DM (1967). The hydrolysis of inositol phosphates by Aerobacter aerogenes. Biochim. Biophys. Acta 132: 412-418.

Greiner R, Konietzny U (2006). Phytase for Food Application. Food Technology and Biotechnology 44: 125–140.

Greiner R (2004). Purification and properties of a phytate-degrading enzyme from Panteoa agglomerans. Protein Journal 23: 567-576.

Greiner R, Haller E, Konietzny U, Jany KD (1997). Purification and characterization of a phytase from Kelbsiella terrigena. Archives of Biochemistry and Biophysics 341: 201–206.

Greiner R, Konietzny U, Jany KD (1993). Purification and characterization of two APases from Escherichia coli. Archives of Biochemistry and Biophysics 303: 107–113.

Gulati HK, Chadha BS, Saini HS (2007). Production and characterization of thermostable alkaline phytase from Bacillus laevolactitus isolated from rhizosphere soil. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology  34: 91-98.

Ha NC, Oh BC, Shin S, Kim HJ, Oh TK, Kim YO, Choi KY, Oh BH (2000). Crystal structures of a novel, thermostable phytase in partially and fully calcium-loaded states. Nature. Struct. Biol. 7: 147–153.

Haefner S, Knietsch A, Scholten E, Braun J, Lohscheidt M, Zelder O (2005). Biotechnological production and applications of phytases. Applied Microbiology and Biotechnology 68: 588–597.

Huang H, Luo H, Yang P, Meng K, Wang Y, Yuan T, Bai Y, Yao B (2006). A novel phytase with preferable characteristics from Yersinia. Biochemical and Biophysical Research Communications 350: 884–889.

Irving GCJ, Cosgrove DJ (1971). Inositol phosphate phosphatase of microbiological origin. Some properties of a partially purified bacterial (Pseudomonas SP.). phytase. Australian Journal of Biological Sciences 24: 547–557.

Jareonkitmongkol S, Ohya M, Watanbe R, Takagi H, Nakamori S (1997). Partial purification from a soil isolates bacterium, Klebsiella oxytoca MO-3. Journal of ferment. Bioeng. 83: 393-394.

Kerovuo J (2000). A novel phytase from Bacillus Characterization and production of the enzyme. PhD thesis.

Kerovuo J, Lauraeus M, Nurminen P, Kalkkinen N, Apajalahti J (1998). Isolation, characterization, molecular gene cloning and sequencing of a novel phytase from Bacillus subtilis. Applied and Environmental Microbiology 64: 2079-2085.

Kim HW, Kim YO, Lee JH, Kim KK, Kim YJ (2003). Isolation and characterization of a phytase with improved properties from Citrobacter braakii. Biotechnology Letter 25: 1231–1234.

Kim OK, Lee JK, Kim HK, Yu JH, Oh TK (1998). Cloning of the thermostable phytase gene (phy). from Bacillus sp. DS11 and its overexpression in Escherichia coli. FEMS Microbiology Letter 162: 185–191.

Konietzny U, Greiner R (2002). Molecular and catalytic properties of phytate degrading enzymes (phytases). International Journal of Food Science Technology 37: 791–812.

Konietzny U, Greiner R (2004). Bacterial phytase: Potential application, in vivo function and regulation of its synthesis. Brazilian Journal of Microbiology 35: 11-18.

Konietzny U, Greiner R, Jany KD (1995). Purification and characterization of a phytase from oat spelt. Journal of Food Biochemistry 18: 165-183.

Lehmann M, Kostrewa D, Wyss M, Brugger R, D’Arcy A, Pasamontes L, van Loon APGM (2000a). From DNA sequence to improved functionality: using protein sequence comparisons to rapidly design a thermostable consensus phytase. Protein Engineering 13: 49–57.

Lehmann M, Lopez-Ulibarri R, Loch C, Viarouge C, Wyss M van Loon APGM (2000b). Exchanging the active site between phytases for altering the functional properties of the enzyme. Protein Science 9: 1866–1872.

Lei GX, Stahl CH (2001). Biotechnological development of effective phytases for mineral nutrition and environmental protection. Applied Microbiology and Biotechnology 57: 474-481.

Lei GX, Poress JM (2003). Phytase enzyology, applications, and biotechnology. Biotechnology Letters 25: 1787-1794.

Lei GX, Porres JM, Mullaney EJ, Brinch-Pedersen H (2007). Phytase: Source, structure and application. Industerial enzymes 505-529.

Lei GX, Ku PK, Miller ER, Yokoyama MT, Ullrey DE (1993a). Supplementing corn-soybean meal diets with microbial phytase maximizes phytate phosphorus utilization by weanling pigs. Journal of Animal Science. 71: 3368–3375.

Lei GX, Ku PK, Miller ER, Ullrey DE, Yokoyama MT (1993b). Supplemental microbial phytase improves bioavailability of dietary zinc to weanling pigs. Journal of Nutrition 123: 1117–1123.

Mullaney EJ, Ullah A (2005). Phytases: attributes, catalytic mechanisms and applications. In Proceedings of the Bouyoucos Conference: Inositol Phosphates in the Soil–Plant–Animal System, Sun Valley, Idaho, USA, 21–24 August 2005. Edited by B. L. Turner, A. E. Richardson, and E. J. Mullaney. 17–18.

Nelson TS, Shieh TR, Wodzinski RJ, Ware JH (1968). The availability of phytate phosphorus in soybean meal before and after treatment with a mold phytase. Poult. Sci. 47: 1842-1848.

Oh BC, Choi WC, Park S, Kim YO, Oh TK (2004). Biochemical properies and substrate specificities of alkaline and histidine acid phytases. Applied Microbiology and Biotechnology 63: 362-372.

Olczak M, Morawieka B, Watorek W (2003). Plant purple acid phosphatases- genes, structures and biological function. Acta Biochimica Polonica 50: 1245-1256.

Pandy A, Selvakumar P, Soccol CR, Nigam P (1999). Solid state fermentation for the production of industrial enzymes. Current Science 77: 149-162.

Pandey A, Szakacs G, Soccol CR, Rodriguez-Leon JA, Soccol VT (2001). Production, purification and properties of microbial phytases. Bioresource Technology 77: 203-214.

Pasamontes L, Haiker M, Henriquez-Huecas M, Mitchell DB, van Loon APGM (1997). Cloning of the phytase from Emericella nidulans and the thermophilic fungus Talaromyces thermophilus. Biochim. Biophys. Acta. 1353: 217–223.

Popanish S, Klomsiri C, Dharmsthiti S (2003). Thermo-acid-tolerant phytase production from a soil bacterium in a medium containing rice bran and soybean meal extract. Bioresource Technology 87: 295-298.

Powar VK, Jagannathan V (1982). Purification and properties of phytate-specific phosphatase from Bacillus subtilis. Journal of Bacteriology 151: 1102–1108.

Quan CS, Zhang LH, Wang YJ, Ohta YY (2001). Production of phytase in a low phosphate medium by a novel yeast. Candida krusei.J. Biosci. Bioeng. 92: 154–160.

Reddy NR, Pierson MD, Sathe SK, Salunkhe DK (1989). Phytases in Cereals and Legumes. Boca Raton, FL: CRC Press.

Reddy NR, Sathe SK, Salunkhe DK (1982). Phytates in legumes and cereals. In: Chichester, C. O., Mrak, E. M., and Stewart, G. F. (Eds.)., Advances in Food Chemistry, Academic Press, New York, 1–92.

Richardson AE, Hadobas PA (1997). Soil isolates of Pseudomonas sp. that utilize inositol phosphates. Canadian Journal of Microbiology 43: 509-516.

Rodrıguez H, Fraga R, Gonzalez T, Bashan Y (2006). Genetics of phosphate solubilization and its potential applications for improving plant growth-promoting bacteria. Plant and Soil 287: 15–21.

Sarikhani MR, Malboobi MA, Aliasgharzad N, Greiner R, Bambai B (2012). Isolation, cloning and characterisation of a novel phytase gene from Pseudomonas putida strain P13. 4^th International Congress Eurosoil, Soil science for the benefit of mankind and environment, 2-6 July, Bari, Italy.

Sarikhani MR, Malboobi MA, Aliasgharzad N, Greiner R, Bambai B (2011). Cloning and characterization of a new phosphatase gene from Pseudomonas putida strain P13. 4^th International Conference on Environmental Industerial and Applied Microbiology, 14-16 September, Malaga, Spain.

Sarikhani MR, Malboobi MA, Aliasgharzad N, Greiner R, Yakhchali B (2010). Functional screening of phosphatase-encoding genes from bacterial sources. Iranian Journal of Biotechnology 8: 275-279.

Sajidan A, Farouk A, Greiner R, Jungblut P, Müller EC, Borriss R (2004). Molecular and physiological characterisation of a 3-phytase from soil bacterium Klebsiella sp. ASR1. Applied Microbiology Biotechnology 65: 110–118.

Selle PH, Ravindran V, Caldwell RA, Bryden WL (2002). Phytate and phytase: consequences for protein utilization. Nutrition Research Reviews 13: 255-278.

Selle PH, Ravindran V  (2007). Microbial phytase in poultry nutrition. Animal Feed Science and Technology 135: 1-41.

Sequeilha L, Lambrechts C, Boze H, Moulin G, Galzy P (1992). Purification and porperties of the phytase from Schwanniomyces castelii. Journal of Fermentation and Bioengineering 74: 7-11.

Shamsuddin AM (2002). Anti-cancer function of phytic acid .International Journal of Food Science & Technology 37: 769 – 782.

Shieh TR, Ware JH (1968). Survey of microorganisms for the production of the production of extracellular phytase. Applied Microbiology 16: 1348-1351.

Shimizu M (1992). Purification and characterization of phytase from Bacillus subtilis (natto). N-77. Bioscience Biotechnology and Biochemistry 56: 12661269.

Shimizu M (1993). Purification and characterization of phytase and acid phosphatase from Aspergillus oryzae K1. Bioscience Biotechnology and Biochemistry 57: 1364-1365.

Shin S, Ha NC, Oh BC, Oh TK, Oh BH (2001). Enzyme mechanism and catalytic property of b-propeller phytase. Structure 9: 851-858.

Suzuki U, Yoshimura K, Takaishi M (1907). Ueberein enzym phytase das anhydro-oxy-methilen diphosphorusaure spaltet. Bulletin of the College of Agriculture, Tokyo Imperial University 7: 503–512.

Tambe SM, Kaklij GS, Kelkar SM, Parekh LJ (1994). 2 distinct molecular-forms of phytase from Klebsiella-aerogenes evidence for unusually small active enzyme peptide. Journal of Fermentation and Bioengineering 77: 23-27.

Tang J, Leung A, Leung C, Lim BL (2006). Hydrolysis of precipitated phytate by three distinct families of phytase. Soil Biology and Biochemistry 38: 1316-1324.

Tomschy A, Brugger R, Lehmann M, Svendsen A, Vogel K, Kostrewa D, Lassen SF, Burger D, Kronenberger A, van Loon APGM, Pasamontes L Wyss M (2002). Engineering of phytase for improved activity at low pH. Applied Environmental Microbiology 68: 1907–1913.

Tye AJ, Siu FK, Leung TYC, Lim BL (2002). Molecular cloning and the biochemical characterization of two novel phytases from B.subtilis 168 and B.Lcheniformis. Applied Microbiology and Biotechnology 59: 190-197.

Ullah AHJ, Sethumadhavan K, Lei XG, Mullaney EJ (2000). Biochemical characterization of cloned Aspergillus fumigatus Phytase (phyA). Biochem. Biophys. Res. Commun. 275: 279-285.

Ullah AHJ, Gibson DM (1987). Extracellular phytase (E.C. 3.1.3.8). from Aspergillus ficuum NRRL 3135: Purification and characterization. Prep. Biochemistry. 17: 83-91.

Van Etten RL (1982). Human prostatic acid phosphatase: a histidine phosphatase. Ann. N. Y. Acad. Sci. 390: 27–51.

Vats P, Banerjee UC (2005). Biochemical characterization of exteracellular phytase (myo-inositol hexakisphosphate phosphohydrolase). from a hyper-producing strain of Aspergillus niger van Teighem. Journal Indian Microbiology and Biotechnology 32: 141-147.

Vats P, Banerjee UC (2004). Production studies and catalytic properties of phytases (myo-inositolhexakisphosphate phosphohydrolases).; an overview. Enzye and Micorbial Technology 35: 3-14.

Vohra A, Satyanarayana T (2003). Phytases: Microbial Sources, Production, Purification, and Potential Biotechnological Applications. Critical Reviews in Biotechnology 23: 29-60.

Vohra A, Satyanarayana T (2002). Purification and characterization of a thermostable and acidstable phytase from Pichia anomala. World Journal of Microbiology and  Biotechnology 18: 687–691.

Wodzinski RJ, Ullah AHJ (1996). Phytase. Advance of Applied Microbiology 42: 263–302.

Wyss M, Brugger R, Kronenberger A, Remy R, Fimbel R, Oesterhelt G, Lehmann M, van Loon APGM (1999). Biochemical characterization of fungal APases (myo-inositol hexakisphosphate phosphohydrolases).: catalytic properties. Applied Environtal Microbiology 65: 367-373.

Yanke LJ, Selinger LB, Cheng KJ (1999). Phytase activity of Selenomonas ruminantium: a preliminary characterization. Lett. Appl. Microbiol. 29: 20–25.

Zinin NV, Serkina AV, Gelfand MS, Shevelev AB, Sineoky SP (2004). Gene cloning, expression and characterization of novel phytase from Obesumbacterium proteus. FEMS Microbiology Letter 236: 283–290.