جداسازی، شناسایی و اندازه‌گیری فعالیت آنزیم‌های فسفولیپاز A2 و هیالورونیداز زهر زنبور عسل ایرانی mellifera meda) (Apis

نوع مقاله : مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 استادیار گروه علوم دامی –دانشکده علوم دامی و صنایع غذایی -دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی خوزستان-ملاثانی-ایران

2 استاد گروه علوم دامی –دانشکده علوم دامی و صنایع غذایی -دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی خوزستان-ملاثانی-ایران

3 استادیار سازمان تحقیقات آموزش و ترویج کشاورزی، مؤسسه تحقیقات واکسن و سرم‌سازی رازی شعبه اهواز، گروه جانوران سمی و تولید پادزهر، اهواز، ایران

چکیده

هدف: زهر زنبور عسل حاوی آنزیم هایی مختلفی نظیر هیالورونیداز و فسفولیپاز A2 است که بعضی از آنها کاربرد دارویی و پزشکی دارند. در تحقیقات متعددی، فعالیت فسفولیپاز A2 و هیالورونیداز در گونه های مختلف زنبور عسل گزارش شده است اما گزارشی در مورد این آنزیم‌ها و چگونگی فعالیت آنها در زهز زنبور عسل ایرانی وجود ندارد. لذا هدف از این تحقیق جداسازی، شناسایی آنزیم‌های فسفولیپاز A2 و هیالورونیداز و اندازه‌گیری میزان فعالیت آنها در زهر خام و اجزای زهر زنبور عسل ایرانی (Apis mellifera meda) بود.  
مواد و روش ها: ابتدا 100 میلی‌گرم زهر خام زنبور عسل با کمک کروماتوگرافی سفادکس G-50 در بافر استات آمونیوم 05/0 میلی مولار خالص‌سازی شد. جهت بررسی پروفایل پروتئینی زهر و  جزءبندی از روش الکتروفورز عمودی استفاده گردید. سپس مقدار پروتئین، فعالیت آنزیم فسفولیپاز A2 و هیالورونیداز در زهر خام و فراکسیو ن‌های جدا شده اندازه‌گیری شد. مقدار پروتئین در زهر خام عسل ایرانی و اجزای آن با استفاده از پروتئین سنجی بروش برادفورد تعیین گردید. میزان فعالیت آنزیم فسفولیپاز A2  با استفاده از سوسپانسیون زرده تخم مرغ به عنوان سوبسترا تعیین شد و میزان فعالیت هیالورونیداز روی هیالورونیک اسید به روش توربیدومتری آزمایش شد. 
نتایج: نتایج اولیه نشان داد که 56 درصد زهر خام پروتئین بوده است. زهر خام به 3 پیک (جزء) مجزا شد. فعالیت فسفولیپاز A2 در زهر خام و پیک اول و دوم مشاهد شد. فراکسیون دوم بیشترین فعالیت فسفولیپازی را نشان داد. فعالیت هیالورونیدازی در زهرخام و تنها در پیک اول مشاهده شد. فعالیت بهینه آنزیم فسفولیپاز A2 در pH برابر 7 و دمای 37درجه سانتیگراد بدست آمد. در این مطالعه مشخص شد که فعالیت هیالورونیداز در زهر زنبور عسل ایران بیشترین فعالیت را در دمای 37 تا 39 درجه دارد و با افزایش درجۀ حرارت به تدریج فعالیت خود را از دست می‌دهد. همچنین نتایج این مطالعه نشان داد که pH ایده‌آل برای فعالیت آنزیم هیالورونیداز 5/5 می‌باشد.
نتیجه گیری: زهر زنبور عسل ایرانی دارای هر دو فعالیت فسفولیپازی و هیالورونیدازی می‌باشد که با استفاده از کروماتوگرافی ژل فیلتراسیون می‌توان آنها را جدا کرد. این بررسی می‌تواند به عنوان روشی برای جداسازی، تخلیص و اندازه‌گیری فعالیت آنزیم‌های هیالورونیداز و فسفولیپاز A2 زهر زنبور عسل ایرانی معرفی شود. آنزیم‌های هیالورونیداز و فسفولیپاز A2 خالص‌ سازی شده می‌توانند جهت استفاده در صنعت و تحقیقات مورد استفاده قرار گیرند. 

کلیدواژه‌ها


عنوان مقاله [English]

Isolation, Characterization, and Biological Activity of Phospholipase A2 (PLA2) and Hyaluronidase from Iranian Honey Bee Venom (Apis Mellifera meda)

نویسندگان [English]

  • Mahmood Nazari 1
  • Hedaiat allah Rooshanfekr 2
  • Fatemeh Salabi 3
1 Assistant Professor, Department of Animal Science, Faculty of Animal science and Food Technology, Agricultural Science and Natural Resources University of Khuzestan, Mollasani, Iran
2 Professor, Department of Animal Science, Faculty of Animal science and Food Technology, Agricultural Science and Natural Resources University of Khuzestan, Mollasani, Iran
3 Assistant Professor, Department of Venomous Animals and Anti-venom Production, Razi Vaccine and Serum Research Institute, Agricultural Research, Education and Extension Organization (AREEO), Ahvaz, Iran.
چکیده [English]

Objective
Bee venom contains various enzymes such as hyaluronidase and phospholipase A2, which have medical and pharmaceutical applications. In several studies, the activity of phospholipase A2 and hyaluronidase has been reported in different bee species, but there is no report about these enzymes and their activities in Iranian honey bee venom. Therefore, the purpose of this research was to isolate, identify phospholipase A2 and hyaluronidase enzymes and measure their activity in crude venom and its fractions of Iranian honey bee (Apis mellifera meda).
Materials and methods
One hundred mg of the crude venom was purified using gel filtration chromatography on sephadex G-50, equilibrated with 0.05mM ammonium acetate buffer. SDS-PAGE was used to determine the protein profile of BV and its fractions. Protein concentration, phospholipase A2 and hyaluronidase enzyme activity of Apis mellifera crude venom and its fractions were measured. Protein concentration of Apis mellifera crude venom and its fractions was determined using Bradford method. Phospholipase A2 (PLA2) activity was determined using suspension of egg yolk as substrate. The activity of hyaluronidase was determined turbidimetrically.
Results
The preliminary results showed that the 56% of crude venom was protein. Crude venom produced three fractions. Phospholipase A2 activity was observed in the crude venom as well as in the first and second fractions. The second fraction showed the highest phospholipase activity. Hyaluronidase activity was observed in crude venom and only in the first fraction. The optimal activity of bee venome phospholipase A2 enzyme was obtained at pH 7 and 37 °C. In this study, it was found that the activity of hyaluronidase in Iranian honey bee venom has the highest activity at 37 to 39 °C and gradually loses its activity as the temperature increases. Also, the results of this study indicate that the optimum pH for hyaluronidase enzyme activity is 5.5.
Conclusions
Iranian honey bee venom has both phospholipase and hyaluronidase activities, which can be separated using gel filtration chromatography. This study can be introduced as a simple method to isolate, purify and measure the activity of hyaluronidase and phospholipase A2 enzymes of Iranian honey bee venom. Purified hyaluronidase and phospholipase A2 enzymes can be used in industry and research.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Apis Mellifera meda
  • Phospholipase
  • Hyaluronidase
بهادر یاسر، محمدابادی محمدرضا، خضری امین و همکاران (1395) مطالعه تنوع ژنتیکی جمعیتهای زنبور عسل استان کرمان با استفاده از نشانگرهای ISSR. پژوهشهای تولیدات دامی 7(13)، 186-192.
ذوالفقاریان حسین، مهاجری محمد، بابایی مهدی، مصوری نادر، جوادی ایرج (1396) بررسی اثر ضدباکتریائی زهر خام زنبور عسل و فراکسیونهای حاصل از آن به روش انتشار از دیسک. نشریه دامپزشکی در پژوهش و سازندگی 114، 126-117.
روحی پور مرضیه، نظری محمود، بیگی نصیری محمدتقی (1398) تعیین ساختار، روابط فیلوژنتیک و تنوع ژنتیکی ناحیه کنترل میتوکندریایی بز عدنی. پژوهشهای تولیدات دامی 10(26)، 89-84.
روحی پور مرضیه، نظری محمود، بیگی نصیری محمدتقی (1399) تعیین ساختار، روابط فیلوژنتیک و تنوع ژنتیکی ناحیه کنترل میتوکندریایی بز عدنی. مجله ژنتیک نوین 15(4)، 304-297.
محمدآبادی محمدرضا، کرد محبوبه، نظری محمود (1397) مطالعه بیان ژن لپتین در بافتهای مختلف گوسفند کرمانی با استفاده از Real time PCR. مجله بیوتکنولوژی کشاورزی 10(3)، 123-111.
محمدی اهوازی غزال، نظری محمود، محمدآبادی محمدرضا، حیدری رضا (1398) آنالیز ژنتیکی و فیلوژنتیکی ناحیه HVR1  میتوکندری در سه نژاد گوسفند ایرانی. مجله ژنتیک نوین 14(3)، 219-211.
مرمضی سالم، میرحسینی محمدعلی (1399) بیان ژن HSP90 و ارتباط آن با دمای محیط و تردد زنبور عسل ایرانی. مجله بیوتکنولوژی کشاورزی 12(4)، 204-181.
 
References
Abdel-Monsef Mohammed M, Zidan Hind A, Darwish Doaa A, et al. (2020) Biochemical Isolation and Characterization of Hyaluronidase Enzyme from Venom of Egyptian Honey Bee Apis Mellifera Lamarckii. J Apic Sci 64(1), 153-164.
Alia O, Laila M, Antonious A (2013) Antimicrobial effect of melittin isolated from Syrian honeybee (Apis mellifera) venom and its wound healing potential. Int J Pharm Sci Rev Res 21, 318-324.
Babaie M, Ghaempanah A (2020) Evaluation of hemolytic activity and biochemical properties of Apis mellifera bee venom on NIH laboratory mice. J Neyshabur Univ Med Sci 8(3), 23-34.
Bahador Y, Mohammadabadi M, Khezri A, et al. (2016) Study of genetic diversity in honey bee populations in kerman province using ISSR markers. Res Anim Prod 7, 186–192 (In Persian).
Bordon KC, Wierel GA, Amorim FG, et al. (2015) Arthropod venom hyaluronidases bio­chemical properties and potential applications in medicine and biotechnology. J Venom Anim Toxins Incl Trop Dis 22(21), 43.
Bradford MM (1976) A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analy Biochem 72(1), 248-54.
Darwish DA, Masoud HMM, Abdel-Monsef MM, et al. (2021) Phospholipase A2 enzyme from the venom of Egyptian honey bee Apis mellifera lamarckii with anti-platelet aggregation and anti-coagulation activities. J Genet Eng Biotech 19(1), 10.
Dennis EA (1997) The growing phospholipase A2 superfamily of signal transduction enzymes. Trends Biochem Sci 22, 1-2.
Ghabili K, Shoja MM, Parvizi M (2009) Bee venom therapy: a probable etiology of aneurysm formation in aorta. Med Hypotheses 73(3), 459-60.
Greenfield EA (2018) Protein Quantitation. Cold Spring Harbor Protocols. 6th edition: pdb.prot098202
Kemeny DM, Dalton N, Lawrence A, et al. (1984) The purification and characterisation of hyaluronidase from the venom of the honey bee, Apis mellifera. Eur J Biochem 139, 217-223.
Ketelhut DFJ, Mello MH, Veronese ELG, et al. (2003) Isolation, characterization and biological activity of acidic phospholipase A2 isoforms from Bothrops jararacussu snake venom. Biochemie 58, 983-91.
Laemmli UK (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227, 680-685.
Lima PR, Brochetto-Braga MR (2003) Hymenoptera venom review focusing on Apis mellifera. J Venom Anim Toxins Incl Trop Dis 9, 149-162.
Marinetti GV (1965) The action of phospholipase A2 on lipoproteins. Biochem Biophys Acta 98, 554-6.
Marković-Housley Z, Miglierini G, Soldatova L, et al. (2000) Crystal Structure of Hyaluronidase, a Major Allergen of Bee Venom. Structure 8(10), 1025-1035.
Moga MA, Dimienescu OG, et al. (2018) Anticancer Activity of Toxins from Bee and Snake Venom- An Overview on Ovarian Cancer. Molecules 23(3), 692-713.
Mohamadi ahvazi Gh, Nazari M, Mohamadabadi MR, et al. (2019) Genetic and phylogenetic analysis of mitochondrial HVR1 region in three breeds of Iranian sheep. Mod Genet J 14(3), 211-219 (In Persian).
Mohammadabadi M, Kord M, Nazari M (2018) Studying expression of leptin gene in different tissues of Kermani Sheep using Real Time PCR. Agric Biotech J 10(3), 111-123 (In Persian).
Morammazi S, Mirhosseini MA (2020) Expression of HSP90 Gene and its Relationship with Ambient Temperature and Foraging Rate in Apis Mellifera Meda. Agric Biotech J 12(4), 185-205 (In Persian).
Morey SS, Kiran K, Gadag J (2006) Purification and properties of hyaluronidase from Palamneus gravimanus (Indian black scorpion) venom. Toxicon 47(2), 188-95.
Murakami M, Sato H, Miki Y, et al. (2015) A new era of secreted phospholipase A2. J Lipid Res 56, 1248-1261.
Owen MD, Pfaff LA, Reisman RE, et al. (1990) Phospholipase A2 in venom extracts from honey bees (Apis mellifera L.) of different ages. Toxicon 28(7), 813-820.
Pattabhiramaiah M, Ramesh K, Vishwanath KV, et al. (2020) Computational analysis of PhospholipaseA2 in the honey bee venom. J Apic Res 59(4), 706-721.
Pessini AC, Takao TT, Cavalheiro EC, et al. (2001) A hyaluronidase from Tityus serrulatus scorpion venom: isolation, characterization and inhibition by flavonoids. Toxicon 39(10), 1495-504.
Pukrittayakamee S, Warrell DA, Desakorn V, et al. (1988) The hyaluronidase activities of some Southeast Asian snake venoms. Toxicon 26(7), 629-37.
Rohipoor M, Nazari M, Beigi Nassiri MT (2019) Genetic and Phylogenetic Analysis of Adani Goat Population Based on Cytochrome B Gene. Res on anim prod 10(26), 84-89 (In Persian).
Rohipoor M, Nazari M, Beigi nassiri M (2021) Population structure, Genetic diversity and phylogenetic analysis of control region of mtDNA in Adani goat breed. Mod Genet J 15(4), 297-304 (In Persian).
Salabi F, Jafari H (2022) New insights about scorpion venom hyaluronidase; isoforms, expression and phylogeny. Toxin Rev. DOI: 10.1080/15569543.2021.2018613
Samel M, Vija H, Kurvet I, et al. (2013) Interactions of PLA2-s from Vipera lebetina, Vipera berus berus and Naja naja oxiana venom with platelets, bacterial and cancer cells. Toxins 24, 203-223.
Santos KS, Stephano MA, Marcelino JR, C, et al. (2013) Production of the First Effective Hyperimmune Equine Serum Antivenom against Africanized Bees. PLoS ONE 8(11), e79971.
Topchiyeva A, Mammadova FZ (2016) The seasonal activity of hyaluronidase in venom of a honey bee (Apis mellifera L. caucasica) in various regions of Azerbaijan. J Ento and Zoo Stu 4(4), 1388-1391.
Topchiyeva S, Farida M (2015) The Study on Activity of Bee Venom Phospholipase A2 from Apis mellifera caucasia L in Honey Bees. Nova J Med and Bio Sci 4(3), 1-10
Zolfagharian H, Mohajeri M, Babaie M, et al. (2016) Investigation of the Antibacterial effect of crude venom of honey bee (Apis mellifera) and its fractions by disk diffusion method. Vet J (Pajouhesh & Sazandegi) 114, 117-126 (In Persian).