روش های تولید پرندگان تراریخت و کاربرد آنها در زیست فناوری

روش های تولید پرندگان تراریخت و کاربرد آنها در زیست فناوری

محمد رضا نصیری¹، شاهرخ قوّتی *²، محمد رضا محمدآبادی³، حمید آریان نژاد²، محمد دوستی²

¹ دانشیار گروه علوم دامی و پژوهشکده بیوتکنولوژی و فناوری زیستی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه فرودوسی مشهد

² دانشجوی دکتری تخصصی، گروه علوم دامی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه فردوسی مشهد

³ دانشیار گروه علوم دامی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه شهید باهنر کرمان

تاریخ دریافت: 13/12/1388، تاریخ پذیرش: 07/02/1390

چکیده

طی چند دهه گذشته توانایی ایجاد تغییرات مستقیم ژنتیکی در سطح ملکولی انقلاب عظیمی را در علم زیست شناسی بوجود آورده است. فناوری موجود در تراریخت­ها، امکان پیوند تکنیک­های مختلف را در زمینه­های جنین شناسی، بیولوژی سلولی و ژنتیک ملکولی فراهم کرده است. امروزه پرندگان تراریخت به عنوان ابزارهای تحقیقاتی مفید و مؤثر در بسیاری از مؤسسات مورد استفاده قرار می­گیرند. بسیاری از دانشمندان معتقدند که قبل از تحقیق در این مورد، ابتدا باید روش­های تولید پرندگان تراریخت متداول شوند. با توجه به پیشرفت چشمگیر علم زیست فناوری، دستکاری مستقیم جنین به وسیله DNA و یا حامل­های ویروسی امکان پذیر شده است. اما به طور عموم، این روش­ها توانایی ایجاد جایگاه اختصاصی برای دستکاری ژنوم را ندارند. برای رفع این مشکل، اخیراً روش های مختلفی برای تولید جوجه های تراریخت بر پایه استفاده از سلول­های بلاستودرم (BDCS)، سلول­های بنیادی جنین (ESCs)، سلول­های زایای بدوی (PGCS) و سلول­های بنیادی اسپرماتوگونیال (SSCs) پیشنهاد شده و توسعه یافته است. لذا سیستمی کامل برای جداسازی، تکثیر، آلوده کردن، انتخاب و تکثیر مجدد محیط کشت سلول­های بنیادی جنینی و به دنبال آن تولید میزان بالایی شمیر سوماتیک بهبود داده شده و نتایج آن در مقالات جدید علمی گزارش شده است. نشان داده­ شده که روش کشت بیضه­ای سلول های اسپرماتوگونیال جدیدترین، ساده­ترین و پربازده­ترین روش تولید جوجه­های تراریخت در طی سالهای اخیر بوده است. در این روش از SSCs­ها به عنوان القاگر در مراحل بیولوژیکی تولید اسپرم برای ایجاد جوجه های تراریخت استفاده می شود. اگرچه استفاده از سیستم­های ویروسی می­تواند باعث انتقال ژن با بازدهی بالا شوند، اما مسائل ایمنی موجود، کاربرد عملی آن­ها را محدود کرده است. در حال حاضر برای ایجاد پرندگان تراریخت از ترکیب روش­های تولید سلولهای زایای شیمر و دستکاری سلولی بنیادی پرتوان نیز استفاده می­شود. در این مقاله سعی شده مهمترین روش­های تولید جوجه­های تراریخت، روش­های انتقال ژن و همچنین کاربرد جوجه­های تراریخت به عنوان راکتور زیستی در زیست فناوری تشریح شود.

کلمات کلیدی: جوجه­های تراریخت، انتقال ژن، دستکاری ژنتیکی، سلول­های پر توان، حامل­های ویروسی، سلولهای بنیادی.

مقدمه

در طی دهه گذشته تحقیقات انجام شده در زمینه­های داروشناسی، پزشکی، ژنتیک، کشاورزی و مهندسی داروهای زیستی در اکثر کشورهای پیشرفته نیاز به تولید حیوانات تراریخت را اثبات نموده اند. وجود مزیت­های تکنیکی قابل توجه در پرندگان سبب شده با وجود گزینه­های مختلف برای تولید پروتئین­های نوترکیب[1]، جوجه­های تراریخت[2] به عنوان منبع تجاری مهمی برای تولید مورد توجه قرار گیرند. این مزیت­ها شامل موارد زیر است: 1-دوره رشد کوتاه (متوسط 5 ماه درمرغ­سانان[3])، 2- ردیابی جوجه­های حاوی ژن انتقال یافته در مدت کوتاه تر (Lillico et al., 2005)، 3- تولید بیشتر ژن انتقال یافته (خروس بارور می­تواند هر سه روز به ازای ده مرغ منی تولید کند، هر مرغ گیرنده می­تواند بعد از لقاح ده تخم زایا تولید کند و مرغان بالغ ماده سالانه در حدود 330 تخم تولید می­کنند) و 4- ساختار ساده پروتئین­های تخم که به شکل معنی داری در خالص­سازی پروتئین نوترکیب تاثیر مثبت دارد (Dunn et al., 2005). لذا، پرندگان به سبب هزینه تولید کمتر، محیط استریل طبیعی تخم و تولید مقدار زیاد پروتئین در تخم گزینه­های مناسبی برای تولید پروتئین­های درمانی در صنعت داروسازی هستند (Dunn et al., 2005). اگرچه در بیست سال گذشته موش­های تراریخت بیشتر برای انجام تحقیقات تجاری مورد توجه بوده­اند، اما تکنولوژی تولید جوجه­های تراریخت نیز همزمان با پستانداران رشد کرده است. اولین موش تراریخت را
 Gordon et al., (1980) با استفاده از تکنیک انتقال ژن به پیش هسته[4]، ایجاد کردند. با وجود محدودیت­هایی همچون انتقال تصادفی و جهش در قطعه انتقال داده شده، که سبب کاهش راندمان تولید تراریخت­ها می­شدند، تزریق به پیش هسته به عنوان پرکاربردترین فناوری تولید تراریخت­ها مورد استفاده قرار گرفته است (Ono et al., 1994). تفاوت­های معنی دار مانند روند عبور تخم از اویداکت، نیاز به پوسته برای رشد و دشواری جداسازی سلول­های زایا یا بنیادی جنین پرندگان که در سیستم­های تولیدمثلی گونه­های پرندگان نسبت به پستانداران وجود دارد، باعث شد که محققین روش­های متفاوتی را برای تولید پرندگان تراریخت مورد استفاده قرار دهند. در گزارشات قبلی به دو روش عمده برای تولید پرندگان تراریخت اشاره شده است که به دو روش مستقیم و غیر مستقیم تقسیم می­شوند. در روش مستقیم، جنین با استفاده از DNA و یا حامل­های ویروسی دستکاری می­شود. روش­های غیر مستقیم مختلفی بر پایه سلولی، برای تولید جوجه­های تراریخت توسعه یافته­اند، که در آن­ها به طور عمده از سلول­های بلاستودرم[5] (BDCS)، سلول­های بنیادی جنین[6] (ESCs)، سلول­های زایای بدوی[7] (PGCS) و سلول­های بنیادی اسپرماتوگونیال[8] (SSCs) استفاده می شود. محققین برای تولید موفقیت آمیز حیوانات تراریخت دو اصل مهم را در نظر گرفته اند. اول این که آن­ها سعی نمودند که سلول­های هدف در حیوانات مختلف را بدون کاهش در قابلیت زیستی سلول به طور مؤثری دستکاری کنند و دوم این که دستکاری ژن هدف سبب تغییر عملکرد نرمال ژن نشود. هدف از این مقاله مروری بر انواع روش های انتقال ژن در پرندگان و میزان موفقیت و کارایی این روش ها در بیان ژن و تولید پروتئین های نوترکیب در پرندگان تراریخت و کاربرد آنها در زیست­فناوری می­باشد.

روش­های مستقیم

در مطالعات اولیه، پژوهشگران تلاش کردند که با استفاده از روش­های مرسوم در پستانداران، پرندگان تراریخت را تولید کنند. محققان در این روش­ها سعی نمودند با تزریق DNA به پیش هسته تخم، پرنده تراریخت ایجاد کنند (Love et al., 1994; Sherman et al., 1998). استفاده از این روش­ها علاوه بر پر هزینه بودن مسایلی را بوجود آوردند، که استفاده از آن­ها را دشوار می­کرد. برای به دست آوردن هر تخم، پرنده­های بالغ می­باید ذبح می­شدند. لذا، تعداد مناسب و کافی تخم برای تولید پرندگان تراریخت بدست نمی­آمد. همچنین این روش­ها به مهارت­هایی ویژه­ای نیاز دارند، زیرا پس از هر تزریق، تخمک باید در خارج از بدن موجود زنده کشت داده شود یا به پرنده ماده دیگری منتقل شود تا نهایتاً یک پرنده زنده متولد شود که هر دوی این روش­ها به سطح قابل توجهی از مهارت­های تکنیکی و زیر ساختی برای انجام سیستم کشت خارج از بدن موجود زنده، نیاز دارند. محققان تلاش کردند با دستکاری مستقیم جنین در دو مرحله اساسی رشد این دو مشکل مهم را از بین ببرند. آنها نشان دادند مرحله بلاستودرم (مرحله X)، تخم تازه بارور شده زمان مناسبی برای قرار دادن جنین دستکاری شده می باشد (Han, 2009). همچنین انکوبه کردن جنین به مدت 72 ساعت، سبب قابل دسترس شدن سلول­های زایای بدوی می­شود که از این سلول ها نیز می توان برای دستکاری جنین استفاده کرد. در سال 2001، پژوهشگران از طریق انتقال مؤثر سلول­های زایا (80 درصد) با استفاده از حامل­های دارای نسخه برداری ناقص رتروویروسی به درون تخم در مرحله بلاستودرم، بلدرچین تراریخت تولید کردند (Mizuarai et al., 2001). برای افزایش بازده بیان ژن و انتقال سلولهای زایا، پژوهشگران تحقیقات را روی مرحله رشد مناسب رویان برای تزریق حامل­های ویروسی انجام دادند. در جوجه­ها چندین طبقه از حامل­های رتروویروسی وجود دارد که در مرحله X به رویان انتقال داده می­شوند. محققان توانستند حداکثر سطح بیان را با تزریق حامل­های رتروویروسی دارای نسخه بردای ناقص درون قلب جنین پس از 55 ساعت انکوباسیون، به دست آورند (Masamichi et al., 2005). همچنین در سال 2009، این پژوهشگران گزارش موفقی مبنی بر تولید آنتی­بادی منوکلونال در زرده و سفیده تخم با استفاده از روش تزریق حامل­های رتروویروسی دارای نسخه برداری ناقص درون قلب جنین پس از 55 ساعت انکوباسیون را ارائه نموده اند (Kamihiraa et al., 2009). امروزه مشخص شده است بیشترین بازدهی هدایت و بیان ژن، زمانی است که ویروس­های محلول در مرحله مناسب (مرحله 14 - 15) به جنین تزریق شوند (Kawabe et al., 2008). این تحقیقات نشان دادند مهاجرت PGCs از جریان خون به گنادها، می­تواند هدف مناسبی برای تولید جوجه­های تراریخت توسط
حامل­های رتروویروسی باشد. بنابراین، با استناد به گزارشات قبلی می­توان گفت رشد مناسب جنین همراه با روش انتقال ژن به وسیله لنتی­ویروس­ها یا رتروویروس­های دارای نسخه برداری ناقص
می­تواند تا حد زیادی باعث بهبود انتقال ژن به پرندگان شود. اگرچه با استفاده از دستکاری مستقیم جنین به وسیله DNA یا حامل­های ویروسی می­توان جوجه­های تراریخت تولید کرد، اما این روش توانایی دستکاری جایگاه اختصاصی (هدف قرار دادن ژن مشخص) در ژنوم را ندارد. زیرا ژن­های منتقل شده به صورت تصادفی در کروموزوم­های میزبان ادغام می­شوند (Van de Lavoir et al., 2006). یکی دیگر از معایب این روش اثرات ناشی از جایگاه قرار گرفتن ژن انتقال داده شده در کروموزوم می­باشد که احتمالاً سبب بیان متغیر تراریخت در بدن میزبان می­شود. به همین دلیل، استفاده از ژن هدف برای تولید پرندگان تراریخت مورد توجه قرار گرفته است. زیرا در این روش احتمال بدست آوردن فنوتیپ قابل پیش­بینی که از نظر اقتصادی دارای اهمیت می­باشد نسبت به وجود لاین­های مختلف از پرندگان که از طریق ادغام تصادفی ژن بدست آمده­اند، بیشتر است (Dodgson, 2007).

روش­های غیرمستقیم

در روش انتقال ژن بر پایه سلولی، ژن هدف درون ژنوم قرار می­گیرد و می­توان بیان ژن انتقال یافته را قبل از انتقال سلول­ها به رویان مورد آزمایش قرار داد. این روش اجازه می­دهد که تراریخت­هایی با اهداف مختلف تولید شود. اولین قدم در تولید تراریخت ها بر پایه سلول، به دست آوردن محیط کشت سلولی مناسب است. از ویژگی­های این محیط کشت می توان به مناسب بودن شرایط برای ورود لاین سلول­های زایا، آلوده شدن از طریق ساختمان DNA و انتقال سلول های آلوده به داخل رویان اشاره کرد. سپس فرزندان نسل G₀ با جوجه­های نسل G₁ که تراریخت را حمل می­کنند آمیزش داده می­شوند (شکل 1). برنامه این تکنیک تلاش می کند تا سه فناوری مهم: الف) توانایی سلول های کشت شده که بتوانند به داخل سلول های زایا وارد شوند، ب) رشد ساختمان مناسب DNA و ج) توانایی تولید سلول­های پیش­ساز گامت شیمر را با هم هماهنگ کند. در سال 1990 اولین جوجه­های تراریخت با سلول های زایایی شیمر تولید شدند و به دنبال آن، تولید طیور با سلولهای زایای شیمر به روشی متداول و عمومی تبدیل شد (Bednarczyk et al., 2000; Speksnijder & Ivarie, 2000; Li et al., 2008).

استفاده از سلول­های بلاستودرم در تولید پرندگان تراریخت

در جوجه­ها، لقاح یک ساعت بعد از تخمک اندازی صورت می­گیرد و رشد رویان سه ساعت بعد از آغاز آمیخته شدن پیش هسته­های نر و ماده شروع می­شود (Perry, 1988). اولین تقسیم دو ساعت به طول می­انجامد و تخمک وارد غده پوسته می­شود. پوسته در طول 20-18 ساعت تشکیل می­شود و تخم در این شرایط حاوی 40000 تا 80000 سلول با مورفولوژی تمایز نیافته است. این مراحل توسط اییال-گیلادی و کوواچ در سال 1976 به نام سلول­های مرحله X نامگذاری شدند (Eyal-Giladi & Kochav, 1976). پژوهشگران بسیاری با استفاده از سلول­های بلاستودرم در مرحله X، سلولهای زایای شیمر تولید کرده­اند (Carsience et al., 1993; Maeda et al., 1997; McGrew et al., 2004). آن­ها پیشنهاد کردند که مرحله X رویانی بهترین مرحله برای تولید جوجه­های شیمر می­باشد زیرا رویان در این مرحله دارای تعداد زیادی سلول با مورفولوژی تمایز نیافته است. همچنین این تحقیقات نشان دادند که سلول­های بلاستودرم علاوه بر حفره جنسی، در درون زرده نیز به مقدار زیادی وجود دارند (Maeda et al.,1997). سلول­های بلاستودرم به عنوان محرک­های ایجاد سلول­های سوماتیک و سلولهای زایای شیمر مورد استفاده قرار می­گیرند. با تابش پرتوی گاما و یا حذف قسمت مرکزی سلول­های بلاستودرم راندمان تولید شیمر بالا می­رود (Carsience et al., 1993; Kagami et al., 1997). تحقیقات نشان می­دهند سلول­های بلاستودرم برای انتقال ژن با استفاده از روش­های مختلف، مثل لیپوزوم­ها و رتروویروس­ها نیز مناسب می­باشند (Kamihiraa et al., 2005, Wang et al., 2006). گزارش شده است تزریق به مرکز گیرنده سلول­های بلاستودرم باعث ایجاد رویان­هایی با سرهای غیرنرمال می­شود (Maeda et al., 1997). مهمترین مشکل این روش نرخ پایین تولید شیمر می­باشد.

شکل 1- گام های اصلی و اساسی در تولید و ایجاد لاین تراریخت. در این نمونه از حامل ویروسی استفاده شده است. با این حال، روش های دیگر مشابه این مراحل می باشند. برای ساخت نسل G₀، ساختمان ویروس باید تولید شود و رویان­ها به وسیله آنها آلوده شوند. رویان ها در محیط کشت Ex Ovo کشت داده می شوند، جوجه­ها متولد می­شوند و بعد از آن تا زمان بلوغ جنسی برای جداسازی موزائیک ها پرورش داده می­شوند. ساخت نسل 1 تا 3 نیاز به زمان، هزینه و امکانات زیادی برای ایجاد و مشخص کردن لاین تراریخت دارد  (Mozdziak & Petitte, 2004).

Figure 1 - General steps in the production and establishment of a transgenic chicken’s line. The viral vectors were used as an example illustrates. However, the process is similar to other methods. Generation 0 (G0) involves the construction and production of virus and the infection of embryos followed by Ex Ovo culture, hatching, rearing, and screening of putative mosaics for breeding. Generations 1–3 (G1–3) require the majority of time, cost, and facilities to establish and characterize a usable line of birds (Mozdziak & Petitte, 2004).

در آزمایشی از 184 تخمی که رویان به آن انتقال داده شده بود، 41 جوجه متولد شدند که فقط شش جوجه شیمر بودند (Ono et al., 1994). سلول­های بلاستودرم پرندگانی که در محیط آزمایشگاهی کشت داده شده­اند نمی­توانند بیش از یک هفته در سلولهای زایای­های شیمر حضور داشته باشند. از آنجایی که سلول­های بلاستودرم قابلیت تمایز دارند، تعدادی از محققان تلاش کردند تا از این سلول­ها به عنوان پیش­ساز سلول­های ESCs استفاده کنند (Pain et al., 1996).

ویژگی­های سلول­های زایای بدوی برای تولید پرندگان تراریخت

سلول­های زایای بدوی (PGCs) سلول­های پیشرو تولید گامت هستند و در پرندگان می­توان آن­ها را به وسیله جدا کردن ناحیه هلال جنسی، که محل انباشتگی این سلول­هاست و یا گرفتن نمونه خون در زمان مهاجرت این سلول­ها بدست آورد (Vick et al., 1993). مهاجرت PGCs در پرندگان با پستانداران تفاوت دارد (جدول 1). در پرندگان ابتدا PGCs در اپی­بلاست[9] تولید می­شود و در مرحله X در مرکز پلوسیدا[10] قرار می­گیرد (Eyal-Giladi & Kochav, 1976). پس از 18 تا 19 ساعت انکوباسیون به هیپوبلاست[11] ناحیه پلوسیدا (هلال جنینی) منتقل می­شود. بین مرحله 10 و 12، PGCs­ها از هلال جنینی به سمت جریان خون حرکت می کنند. آن­ها تا زمانی ­که به برآمدگی جنسی نرفته­اند، در سیستم جریان خون باقی می­مانند (Motono et al., 2010). این سلول­ها از طریق گردش خون جنین به قسمت تاج گناد مهاجرت می­کنند و به گنادهای بالغ تبدیل می­شوند (Nakamura et al., 2007). قابلیت منحصر به فرد PGCs، که سبب انتقال از طریق جریان خون و تسهیل تولید سلولهای زایای شیمری از طریق تزریق آلوژنیک و یا اگزوژنیک می­شود به تولید سلول­های پرتوان می انجامد. سلولهای زایای شیمر با جمع آوری PGCs از خون رویان در طول مرحله 17-13 تولید می­شوند و سپس به رویان­های گیرنده تزریق می­شوند. میزان انتقال سلول­های زایای شیمر در این روش نسبت به سلول­های بلاستودرم بیشتر می­باشد (3/11 تا 96 درصد). پژوهشگران در سال 2004 گزارش کردند که بیشتر تلاش ها برای کشت سلول های بنیادی رویانی پرندگان، بر روی مرحله X بلاستودرم یا PGC می­باشد (شکل 2).

جدول 1- الگوی مهاجرت سلول­های زایای بدوی در پرندگان و پستانداران.

Table 1 - Pattern of primordial germ cells migration in poultry and mammalians.

a) Eyal-Giladi & Kochav

b) Hamburger & Hamilton

PGCs در هر دو گونه از اپی­بلاست نشأت می­گیرد اما دارای مسیرهای مهاجرتی متفاوتی در دو گونه می­باشد (Cherentaeva et al., 2008, Petitte et al., 2004).

شکل2- منشا سلول های پرتوان بنیادی رویان در جوجه ها. سلول های بنیادی رویان در مرحله X رویانی از طریق هسته اولیه جنین، تمایز آزمایشگاهی و از طریق تومور وقتی که به [12]CAM پیوند زنده شده باشند، قابل تشخیص هستند. هنگامی که ESCs به رویان گیرنده مرحله X تزریق می شوند آنها می توانند سبب افزایش لاین شیمری سلول های بنیادی و زایا شوند. سلول های زایای بدوی از مرحله 27 رویان می توانند به عنوان سلول های زایایی رویانی کشت داده شوند. این سلول ها می توانند از هسته اولیه جنین، تمایز آزمایشگاهی و شیمر بنیادی و سلول های شیمر پش ساز گامت نسبت به مرحله جنین گیرنده برای کشت جدا شوند (Petitte et al., 2004).

Figure 2 - The origin of embryonic pluripotent stem cells in the chick. Embryonic stem cells established from stage X embryos can form embryoid core bodies, differentiate in vitro, and form tumor when grafted on the CAM. When ESCs are injected into recipient stage X embryos, they can give increase to somatic/germ line chimeras. Primordial germ cells from the stage 27 embryo can be cultured as embryonic germ cells. Primordial germ cells can derived for culturing form earliest embryoid core bodies, differentiate in vitro, and form somatic chimeras or germ line chimeras depending upon the stage of the recipient embryo (Petitte et al., 2004).

دانشمندان نشان داده­اند PGCs جدا شده می­تواند به دیگر گیرنده­های رویان، در مرحله­ای که PGCs در خون در حال گردش است انتقال یابند (Mozdziak et al., 2006). بنابراین راه دیگر برای تولید شیمرها، انتقال ژن به PGCs و سپس اتصال آن به جنین­های گیرنده است. از آنجاکه PGCs منشاء اسپرم و تخمک می­باشند انتظار می­رود بازدهی انتقال به سلولهای زایای بالاتر باشد. همچنین کشت آزمایشگاهی PGCs سبب افزایش راندمان انتقال سلولهای زایای می­شود.
 et al., (2006) Van de Lavoir سیستم قدرتمندی را ارائه کردند که از طریق آن PGCs­ها می­توانند برای مدت طولانی در محیط کشت باقی بمانند، در حالی که توانایی تبدیل شدن به سلولهای زایا را همچنان حفظ کنند. با این حال مقدار PGCs که از خون جنین بدست می­آید (به میزان کمتر از 05/0 درصد از کل سلول­های خون) مهمترین و اصلی­ترین محدودیت تکنیکی استفاده از PGCs برای انتقال ژن می­باشد (Park et al., 2003). برای از بین بردن این محدودیت محققان پیشنهاد کردند که PGCs را از گنادهای جنین جدا کنند. در سال 1994 پژوهشگران توانستند برای اولین بار PGCs را از گناد 5 روزه جدا کنند (Allioli et al., 1994). گروهی از پژوهشگران به طور مستقیم بازدهی PGCs را در جنین­های 5/2 و 5 روزه از نظر مهاجرت به گنادهای دریافت کننده، مقایسه کردند و موفق شدند با استفاده از gPGCs آلوده شده با حامل لنتی ویروسی، نسل تراریخت ایجاد کنند (Motono et al., 2010). برای افزایش راندمان انتقال سلولهای زایا و تغییرات ژنتیکی، محققان سه روش استفاده از امولسیون بو­سولفان[13] برای غیرفعال کردن PGCs اندوژنوس، حذف با جراحی قسمت مرکزی ناحیه پلوسیدا و استفاده از تابش اشعه ایکس و یا گاما به تخم پذیرنده را پیشنهاد کرده­اند (Furuta & Fujihara, 1999; Kagami et al., 1997; Lim et al., 2006)

توانایی­های سلول­های بنیادی اسپرم

در پژوهش­های گذشته، به مقدار زیادی از سلول­های بلاستودرم، سلول­های بنیادی جنین و سلول­های زایای بدوی برای تولید پرندگان شیمر استفاده می­شد و القاگرهای انتقال سلولهای زایا، از رویان توسعه یافته جوجه بازیافت می شدند. این روش­ها بسیار دشوار و زمان بر بودند، زیرا همه آن­ها به تولید تعداد زیادی حیوان تراریخت نیاز دارند و این حیوانات باید تا زمان بلوغ جنسی برای آزمون­های مولکولی و تلاقی آزمون (تست کراس) نتاج بدست آمده از جنین­های دستکاری شده، نگهداری شوند (Li et al., 2008). همچنین بازیافت مجدد PGCs از رویان هنوز ناکارآمد می­باشد و دستورالعمل این روش از نظر تکنیکی دارای مشکل می­باشد. از این رو در سالهای اخیر پژوهشگران روش SSCs را برای تولید پرندگان تراریخت مورد توجه قرار داده­اند. سیستم کشت بیضه­ای از سلول­های سوماتیک اسپرماتوگونیال در موش برای اولین بار در سال 1994 پیشنهاد شد (Brinster & Zimmermann, 1994; Brinster & Avarbock, 1994). پس از آن مطالعات روی موش نشان داد که سلول­های بیضه دارای بخشی کوچکی از SSCs هستند که می­توانند منشاء اسپرتوماژنوسیز باشند (Hamra et al., 2005; Kanatsu-Shinohara et al., 2003). به دنبال آن پژوهشگران توانستند SSCs را در سلول­های بیضه پرندگان شناسایی کنند (Jung et al., 2007). به طور کلی PGCs داخل گنادهای رویانی می­باشد و در حیوانات نر، درون اسپرماتوگونیال بیضه انتقال می­یابد. سیستم کشت بیضه از مراحل بیولوژیکی تولید اسپرم بهره برده و از SSCs به عنوان القاگر در جوجه­های تراریخت استفاده می­کند. میزان تولید اسپرم به SSCs بستگی دارد که سهم کوچکی از سلول­های بیضه را شامل می­شوند اما دارای نقش بسیار مهمی می­باشند. تعداد سلول­های SSCs در بیضه­های جوجه­ها به شدت با افزایش سن تغییر
 می­کنند. این روش می­تواند در بیضه وضعیت شیمر موضعی ایجاد و حیوانات تراریخت هموزیگوت در نسل G₁ تولید کند. پژوهشگران اعتقاد دارند انتقال مناسب ژن به درون مخلوطی از سلول­های بیضه اولیه که ممکن است هدفش SSCs باشد، مسیر تولید پرندگان تراریخت را هموارتر می­کند (Lee et al., 2006). در این روش لاین سلول­های پرتوان تنها با استفاده از تشخیص آزمایشگاهی از بیضه­های بالغ بدست می­آید و سپس به طور مستقیم به بیضه­های بالغ تزریق می­شود. بنابراین، نیاز به بازیابی سلول­های PGCs نیست و زمان برای آزمون­های مولکولی و تلاقی آزمون کاهش پیدا می­کند. همچنین سیستم کشت بیضه ای در مقایسه با کشت رویانی، به مدت زمان کمتری نیاز دارد و می­توان شیمری مشابه سیستم کشت رویانی تولید کرد. در برخی از تحقیقات سیستم رتروویروسی برای دستکاری ژنتیکی SSCs مورد استفاده قرار می­گیرد. اخیراً حامل­های لنتو­ویروسی نیز برای تولید موش­ها و خرگوش های تراریخت مورد استفاده قرار گرفته­اند (Park, 2007). در سال های اخیر روشی با بازدهی بالا برای جداسازی، خالص­سازی و کشت SSCs در شرایط آزمایشگاهی توسط پژوهشگران طراحی شده است (Park, 2007). همچنین پژوهشگران نشان دادند که سلول­های بیضه جوجه می­تواند به طور مؤثری در آزمایشگاه با یک حامل رتروویروسی گزارشگر دارای نسخه برداری ناقص، که توسط گلیکوپروتئین (VSV-G)[14] سطح آن پوشیده شده است، آلوده شوند (Borwornpinyo et al., 2005). محققان با استفاده از اطلاعات بدست آمده، SSCs آلوده شده را به شکل مستقیم به بیضه خروس منتقل کردند و جوجه­های تراریخت با بازدهی بالایی تولید کردند (Li et al., 2008). پژوهشگران دیگری نیز SSCs را از بافت بیضه جنین جدا کردند و آن­ها را برای بیشتر از 2 ماه بعد از خالص­سازی در شرایط آزمایشگاهی کشت دادند. علاوه بر این، آن­ها دریافتند که SSCs منتقل شده می­توانند در غشای بازال قرار گرفته، تکثیر شوند و به اسپرم تمایز یابند (Yu et al., 2010). این روش ساده و مؤثر، مسیر جدیدی برای تولید جوجه­های تراریخت در مقیاس بالا فراهم کرده است. تمامی این مطالعات نشان می­دهند که روش عملی برای تولید پرندگان تراریخت استفاده از SSCs می­باشد.

دستکاری رویان

یکی از بزرگترین مشکلاتی که برای تولید جوجه­های تراریخت با استفاده از روش­های مختلف وجود دارد، دستکاری رویان برای وارد کردن ژن خارجی درون سلول­های جرملاین می­باشد. در گذشته پنجره­ای کوچک در پوسته تخم ایجاد و بعد از دستکاری رویان، پوسته با یک ماده چسبنده مهر و موم می­شد در نتیجه قابلیت جوجه­درآوری با استفاده از این روش قدیمی و ساده بسیار پایین بوده است (شکل 3) (McGrew et al., 2004; Petitte et al., 1990). قابلیت جوجه­درآوری مناسب تخم­های پنجره­دار برای تولید پرندگان تراریخت کارآمد، بسیار مهم است. قابلیت جوجه¬درآوری تخم دستکاری شده با خرد نکردن پوسته و پوشاندن پنجره با استفاده از PBS[15] بهبود پیدا کرد. بعد از آن محققان غشای پوسته را در حالیکه تحت تاثیر PBS بود، برش دادند و سلول­ها را درون رویان تزریق و تخم را توسط غشا پوسته و چسب Duce مهر و موم کردند (Speksnijder & Ivarie, 2000). قابلیت جوجه­درآوری روش پنجره­ای با استفاده از این عمل از 6 درصد به 30 درصد افزایش یافت. با تزریق رتروویروس­ها در روش پنجره­ای قابلیت جوجه­درآوری 23 تا 35 درصد بهبود یافت (Harvey et al., 2002a). همچنین قابلیت جوجه­درآوری با انکوبه کردن تخم­ها برای 7-5 روز قبل از تزریق سلول­ها به قسمت انتهایی تخم، افزایش یافت (Bednarczyk et al., 2000). یکی دیگر از موارد مورد توجه در روش پنجره­ای­، استفاده از سیستم کشت Ex Ovo مایع تازه تخم می­باشد (Perry, 1988). به طور خلاصه، در این روش محتوای مایع تازه تخم در پوسته تخم جوجه­ها قرار داده می­شود و رویان­ها توسط حامل مناسب تزریق می­شوند. قسمت جدا شده پوست تخم جوجه­ها با Saran-Warap به مدت سه روز پوشیده می­شود. به دنبال آن رویان جوجه­ها داخل قسمت جدا شده از پوسته تخم که با Handi-warp قبل از جوجه­درآوری پوشیده شده، منتقل می­شود.

شکل 3- روش کشت رویان با استفاده از ایجاد پنجره در پوسته تخم. شکل­های A تا G مراحل نشانه گذاری محل پنجره بر روی تخم و ساخت یک غشای تفلون که با استفاده از آن می توان در داخل رویان را مشاهده نمود نشان می­دهد. (A) حلقه پلاستیکی بر روی محل قرارگیری رویان قرار داده شده و این وضعیت نشانه گذاری می­شود. (B) اندازه حلقه با اندازه تخم و یا رویان در ارتباط است. حلقه­های پلاستیکی و حلقه­های لاستیکی برای بلدرچین و جوجه­ها مناسب هستند. (C) حلقه­ها در داخل موم ذوب شده غوطه ور می شوند. (D) سپس حلقه ها بر روی غشای تفلون قرار داده می شود. حلقه لاستیکی بر روی حلقه پلاستیکی قرار گرفته و سبب محافظت بیشتر محیط داخل تخم می­شود. (E) بعد از شکل دادن و برش مناسب غشای تفلونی، حلقه بر روی قسمت بالای رویان قرار می­گیرد. (F) موم ذوب شده در اطراف حلقه پلاستیکی ریخته می­شود. (G) مرحله (F) را در تخم بلدرچین نشان می دهد. (H) تخم در زیر میکروسکوپ قرار داده می­شود (با رنگ آبی روشن شود). (J) میکروسکوپ با اتاقک گرمایی پوشیده می­شود. (K) مسیر مشاهده در میان پنجره تفلونی  که شامل غشایی تفلون می­باشد. (t) مایع بالایی آلبومین و محلول رینگر، (a) قسمت بالایی رویان بر روی سطح زرده می باشد و (b) موم می­باشد (Kulesa et al., 2010).

Figure 3 - Embryo culture method using a window in the eggshell. (A-G) In Ovo imaging begins with marking the position of the presumptive window in the eggshell and creating a Teflon membrane that will fit into the window to provide an optical pathway to the embryo. (A) An acrylic ring is placed over the embryo and its position is marked. (B) The ring diameter can vary depending on the size of the egg or embryo. Acrylic rings and rubber O-rings appropriate for quail and chick eggs are shown. (C) An acrylic ring is dipped into melted beeswax before (D) being placed onto a Teflon membrane and secured in place with a rubber O-ring around its circumference. (E) After stretching and cutting the Teflon to fit tightly over the acrylic ring, the ring is placed into the hole in the eggshell over the embryo (the embryo contrast has been adjusted to better visualize its position). (F) Warmed beeswax (highlighted in green) is spread around the ring to seal it into the eggshell. (G) The same method applied to a quail egg. (H) The egg is placed on the microscope stage under the objective, which is (J) surrounded by a heated chamber. (K) The optical pathway through the Teflon window includes the Teflon membrane (t), laid above the albumen and Ringer’s solution (a) that sits over the embryo on top of the yolk surface; (b) beeswax (Kulesa et al., 2010).

تغییرات ایجاد شده توسط محققین در روش اصلی سبب شد قابلیت جوجه­درآوری هنگامی که از رتروویروس­ها استفاده می­شوند 20 تا 35 درصد افزایش یابد (Perry, 1988; Rowlett & Simkiss, 1987). در تحقیقی خروس­های G₀با استفاده از رتروویروس ها تولید شدند که دارای قابلیت جوجه¬درآوری مناسبی بودند. این خروس ها ژن lacZ را در منی خود حمل می­کردند (Mozdziak et al., 2003). در حال حاضر روش پنجره­ای و محیط کشت Ex Ovo تنها روش­هایی هستند که می­توان با استفاده از آن­هاDNA  بیگانه را درون رویان جوجه­ها منتقل کرده و فرزندان زیست­پذیری بوجود آورد.

روش­های انتقال ژن

روش­هایی که برای ایجاد پرندگان تراریخت استفاده می­شوند بیشتر به منظور انتقال ژن­های خارجی درون سلول­های هدف می­باشند. در این روش­ها بیشتر از رتروویروس­های مرغی استفاده می­شود. حامل­های نسخه برداری ویروس لکوسیز مرغی[16] و حامل­های نسخه برداری ناقص بدست آمده از ویروس رتیکولوندوتلوسیز[17] برای این روش­ها بهینه شده­اند (Bosselman et al., 1989a; Bosselman et al., 1989b; Salter et al., 1986). روش انتقال ژن رتروویروسی برای تولید جوجه­های تراریخت بسیار متداول می­باشد (Harvey et al., 2003a; McGrew et al., 2004;  Mozdziak et al., 2003). حامل­های رتروویروسی، ویروس­هایی دارای ژنوم RNA­ی کوچکی هستند که درون یک هسته پروتئینی حاوی اینتگراز[18]، آنزیم رونویس معکوس و پروتئاز قرار دارند. پروتئین­های باند شونده ویروسی گیرنده­های ویژه بر روی سلول­های میزبان را گسترش می­دهند و ذرات ویروسی توسط اندوسیتوز گیرنده­های میانی به سیتوپلاسم سلولی منتقل می­شوند.RNA  به cDNA کپی شده و به داخل هسته انتقال داده می­شود و cDNA توسط فعالیت اینتگراز بر روی توالی­های تکراری انتهایی ویروسی با DNA سلول میزبان ادغام می­شود. DNA پیش­ویروسی می­تواند به RNA ویروسی برای سنتز پروتئین­ها رونویسی شود که این عمل شامل پلی­مراز [19](pol)، آنتی­ژن­های پیوسته گروهی[20]  (gag) و پروتئین­های توسعه دهنده[21] (env) می­باشد. این سه رده پروتئینی هسته ویروسی جدیدی را گردآوری کرده و ژنوم RNA ویروسی را بسته­بندی می­کنند. این بسته جدید پیچیده به داخل سلول­های غشاء میزبان منتقل شده و سپس به خارج از سلول انتقال داده می­شوند. روش استفاده از این ویروس­ها بدین گونه است که قسمت­های غیرضروری و بیماری­زای ژنوم ویروس با قطعه مورد نظرجایگزین شده و سپس ویروس به سلول میزبان انتقال داده می­شود و با ژنوم میزبان ادغام می­گردد. تا به امروز تحقیقات بسیاری روی تولید جوجه یا بلدرچین تراریخت با استفاده از حامل­های رتروویروسی با موفقیت همراه بوده است (Harvey et al., 2002a; Harvey et al., 2002b). وجود محدودیت­هایی از قبیل طول قطعه معرفی شده (کمتر از kb 8)، ادغام ژن انتقال یافته (تنها درون سلول­های تقسیم شده)، تشخیص سلول­های هدف خاص و حساسیت بالا به خاموش شدن ژن سبب افزایش استفاده از حامل­های لنتوویروسی شده است. حامل­های لنتوویروسی که از ویروس کم خونی عفونی اسب مشتق شده­اند، می­توانند به منظور انتقال ژن به سلولهای زایا در مرغ­ها مورد استفاده قرار گیرند (McGrew, 2004). محققین در سال 2002 برای اولین بار از لنتوویروس­ها برای تولید تراریخت­ها استفاده کردند (Lois et al., 2002, Pfeifer et al., 2002). مطالعات بر روی موش و موش صحرایی نشان دادند که تزریق حامل­های لنتوویروسی VSV-Gpseudotyped داخل فضای پرده ویتلین اووسیت بارورشده، موشهای تراریخت با راندمان بسیار بالا (73-68 درصد) تولید می­کند (Lois et al., 2002). حامل­های لنتی ویروسی برای ادغام شدن نیاز به تقسیم سلولی ندارند، زیرا انتقال اطلاعات ژنتیکی آن­ها درون سلول میزبان مستقل از تقسیم سلولی بوده و همچنین آن­ها طیف گسترده­ای از سلول­های میزبان را مورد هدف قرار می دهند (Cockrell & Kafri, 2007). این حامل­ها با راندمان بالایی با ژنوم میزبان ادغام می­شوند به خصوص در سلول­هایی که فعالیت ندارند. ساختار ژنتیکی و کاربرده­های پیچیده حامل های لنتوویروسی در شکل 4 توضیح داده شده است.

این روش ابزار نیرومندی برای بیان ژن­های مطلوب انتقال یافته در بافت اختصاصی یا حذف مستقیم ژن­های نامطلوب در پرندگان می­باشد. بعد از استفاده اولیه از لنتوویروس­ها، کلاس­های مختلفی از حامل­های لنتو­ویروسی برای تولید پرندگان تراریخت مورد استفاده قرار گرفتند. نتایج نشان می­دهد، فراوانی تولید تراریخت­ها با استفاده از این روش 10 تا 100 برابر بیشتر از تراریخت­های به دست آمده با استفاده از روش­های قبلی می­باشد (Chapman et al., 2005; Motono et al., 2010). علاوه بر این، تا به امروز خاموش شدن ژن یا از دست دادن بیان تراریخت در طول زمان و یا نسل­ها به ندرت گزارش شده است.

شکل 4- تولید حامل های لنتی ویروسی. لنتی ویروس های نوع وحشی از سه ژن اصلی تشکیل شده اند (gag, pol & env) و توسط توالی­های انتهایی تکرارشونده احاطه شده اند (رنگ مشکی). سیستم ویروس ها چند ژنی است که به موجب آن ساختمان و بسته بندی ژن ها به صورت بخش های جداگانه به داخل ژنوم میزبان ادغام می شود. ژن env می تواند با گلیکوپروتئین هترولوگوس که از ویروس های مختلف بدست آمده جایگزین شود که بیشتر از VSV-G استفاده می شود. سه پلازمید (یا بیشتر) به داخل لاین سلولی برای تولید حامل های ویروسی انتقال داده می شود (سلول های 293T). برای تولید حامل های ویروسی مایع فاز بالایی جمع آوری می شود و برای تولید تراریخت­ها به وسیله آلوده سازی(A) یا تزریق مستقیم (B) با پروموتور ویروسی و یا سلولی در سلول های بارورشده یا نشده مورد استفاده قرار می گیرد (Park, 2007).

Figure 4 - Lentiviral vector production. The wild-type lentiviral genome is made up of 3 main genes (gag, pol & env) and it is surrounded by long-terminal repeats (black color). The vector system is a split-genome format whereby the packaging and structural genes have been separated and that promotes integration into the host genome. The env gene can be replaced with a heterologous glycoprotein from various viruses, including the prominently used VSV-G. The 3 plasmids (or more) are transfected into a cell line (293T cells) to produce the viral vectors, which are collected in the supernatant for in vitro transgenic applications either by infection (A) or by direct injection (B) can be used with viral or cellular promoter in fertilized or unfertilized cells (Park, 2007).

Prom: viral or cellular promoter, ZP: zona pellucida

در کنار پیشرفت­های فوق العاده استفاده از روش­های ویروسی، معایب و مشکلات خاصی از قبیل مسائل ایمنی، احتمال ادغام رتروویروس­ها در نزدیکی ژنهای سرطان­زای[22] بالقوه و به دنبال آن فعال شدن این ژن­های سرطان­زا و تبدیل شدن این سلول­های با فعالیت طبیعی به سلول­های سرطانی و غیره را به دنبال دارد (Cockrell & Kafri, 2007). لنتوویروس­ها توانایی انتقال قطعات DNAی درحدود  5/8 تا 10 جفت کیلو باز را دارند. بنابراین برای استفاده از این حامل­ها محققین مجبورند پرومتور را کوتاهتر در نظر گیرند و یا قسمت­های از ژن را کوتاه کنند که این سبب تاثیر منفی در تظاهر ژن می شود (Mohammadabadi, 2008). مشکلات موجود در روش­های ویروسی باعث شد پژوهشگران از راه­های دیگری همچون ریزتزریقی، انتقال لیپوزوم، الکتروپوریشن و جداسازی کلسیم فسفات اسید استفاده کنند. ریزتزریقی تخم با انجام سه مرحله از سیستم کشت Ex Ovo باعث جوجه درآوری
می­شود (Love et al., 1994; Sherman et al., 1998). در سال 1994، ریزتزریقی DNA به درون پیش هسته تخم­های جوجه تازه بارور شده گزارش شد، اما به دلیل بازدهی پایین انتقال و مراحل تولید پر زحمت، در تولید پرندگان تراریخت به میزان کمتری استفاده می­شود (Love et al., 1994). مطالعات نشان می­دهد که بازدهی انتقال و میزان بقا سلولی با استفاده از روش الکتروپوریشن در مقابل روش­های لیپوزوم یا کلسیم فسفات اسید بالاتر است (به ترتیب 59/20 در مقابل 75/9 و 61/5 و 86/69 در مقابل 65 و 16/51 درصد) (Yu et al., 2010). محققان توانستند با تزریق 177 رویان گیرنده که سلول­های بلاستودرم آن­ها با الکتروپویشن آمیخته شده بود، شش جوجه زنده تولید کنند (Aritomi & Fujihara, 2000). اما، در مطالعات اخیر روش انتقال لیپوزوم به طور گسترده­ای برای انتقال مؤثر ژن­های خارجی درون سلول­ها و جنین­ها استفاده می­شود (Suraeva et al., 2008; Wang et al., 2006). افزایش میزان لیپید در مخلوط لیپوزوم سبب افزایش به دام افتادن DNA در داخل لیپوزوم می­شود، اما باعث کاهش انتقال DNA به اسپرم نیز می­شود (Ono et al., 1994).

کاربردها

تکنیک­های تراریخت کاربردهای گسترده­ای در پرندگان دارند لذا می­توان به تولید پروتئین­های فعال زیستی با ارزش و تسریع در برنامه­های پرورشی مرسوم به منظور افزایش و بهبود صفات تولیدی مطلوب اشاره کرد. باتوجه به موارد ذکر شده، مهمترین هدفی که در تحقیقات به آن توجه شده، بدست آوردن جوجه یا بلدرچین به عنوان راکتورهای زیستی، با هدف تولید پروتئین­های نوترکیب مفید و بازارپسند می­باشد. زیرا سیستم راکتورهای زیستی پرندگان تراریخت در مقایسه با گیاهان، میکروارگانیسم­ها و پستانداران دارای چندین مزیت بدین شرح می­باشد: 1- تولید پروتئین در تخم پرندگان بیشتر است و همچنین بالغ بر 50 درصد این پروتئین­ها، از بیان ژن­های منفرد حاصل می­شوند، بنابراین بدست آوردن مقدار زیادی پروتئین نوترکیب همراه با خلوص بالا آسان می­باشد (Robert, 2006). 2- الگوی گلیکوزیله شدن برخی از پروتئین­های انسانی شباهت بیشتری به پروتئین­های پرندگان در مقایسه با سایر سیستم­های راکتورهای زیستی دارد (Raju et al., 2000). باید توجه داشت که اگر پروتئینی به شکل اختصاصی گلیکوزیله نشود سبب پاسخ ایمنی و یا باعث آشکار شدن پپتید می­شود. در نتیجه این پروتئین ها به شکل آنتی ژن توسط لنفوسیت های B و T شناخته می­شوند. 3- وجود
مهارکننده­های طبیعی پروتئازی در محتویات تخم و همچنین محیط استریل طبیعی و کوچک سیستم تخم، یک محیط ایده­آل برای ثبات فعالیت بیولوژیکی پروتئین­های خارجی ایجاد می­کند (Rapp et al., 2003). علاوه بر این مطالعات قبلی نشان داده­اند، برخی پروتئین­هایی که برای پستانداران سمی هستند، گاهی اوقات فقط می­توانند در پرندگان تراریخت تولید شوند (Lillico et al., 2007; Zhu et al., 2005). برای مثال، اگر اریتروپویتن انسانی در سیستم پستانی خرگوش بیان شود، اثرات زیان آوری به بار خواهد آورد (Massoud et al., 1996). برای اولین بار در سال 2002 بیان پروتئین بتا لاکتاماز[23] انسانی در جوجه ها آغاز شد ( Harvey et al., 2002a). محققان نشان دادند که می­توان از جوجه­ها به عنوان راکتورهای زیستی در تولید تجاری پروتئین­های نوترکیب استفاده مطلوب کرد. تاکنون
پروتئین­های نوترکیب مختلفی مانند انواع مختلف آنتی­بادی­ها، آنزیم­ها و سیتوکین­ها با استفاده از جوجه و بلدرچین تراریخت در تخم تولید شده است. همچنین فاکتور پروتئین الحاقی نکروز کننده گیرندهFC  تومورها با استفاده از حامل­های ویروسی به شکل نوترکیب در جوجه ها تولید شده است (Kyogoku et al., 2008). اخیرا پژوهشگران توانستند بیان آنتی­بادی­های منوکلونال را در جوجه­ها با موفقیت اجرای کنند. سپس با ذبح جوجه­های تراریخت با استفاده از آزمون وسترن بلات حضور آنتی­بادی ها را در بافت­های مختلف ردیابی کردند (Kamihiraa et al., 2009). به همین ترتیب، لاکتوفرین انسانی به شکل نوترکیب در جوجه­های تراریخت تولید شد. پروتئین تولید شده دارای فرم گلیکوزیله و مشخصات فیزیولوژیکی یکسانی با لاکتوفرین بدست آمده ازشیر انسان بود. همچنین پژوهشگران نشان دادند که فعالیت آنتی اکسیدانی و فعالیت ضد میکروبی لاکتوفرین تولید شده در این سیستم با لاکتوفرین خالص شده از شیر انسان یکسان است (Tutykhina et al., 2009). پیشرفت های اخیر در فن­آوری جوجه های تراریخت و نتایج اولیه بیان پروتئین ها در پرندگان دلگرم کننده می­باشد (جدول 2). امید به توسعه پرندگان تراریخت برای تولید پروتئین های درمانی به شکل تجاری، در چند سال آینده به واقعیت تبدیل خواهد شد. شرکت­های بزرگ زیست فناوری به شکل فعالانه به دنبال تحقق این هدف هستند. هنوز تعداد زیادی سوال بی­جواب باقی مانده است که می­بایست به آنها در سطح تولید پروتئین، تغییرات بعد از ترجمه و خالص سازی استاندارد جواب داد و سپس آن را به تصویب سازمان­های نظارتی رساند.

با توجه به تحقیقات انجام شده قبلی، دو روش برای تولید پروتئین های نوترکیب در تخم وجود دارد. انتقال ژن مورد نظر به سلول های اویداکت یکی از این روش هاست (Kawabe et al., 2008; Lillico et al., 2007). این روش شامل استفاده از پرموتورهای خاص بافت مثل پروموتور ovalbumin یا پروموتورهای ساختمانی می­باشد. روش دیگر تولید پروتئین­های هدف دارای ناحیه Fc یک آنتی­بادی درون خون می­باشد، که باعث تجمع پروتئین­ها درون زرده از طریق انتقال LgY می­شود (Kamihiraa et al., 2009; Kyogoku et al., 2008). اگر چه که در روش دوم پروتئین­های هدف ممکن است به آنتی­بادی­ها و پروتئین­های ادغامی Fc محدود شده باشند، اما روش موثری برای افزایش و بهبود پروتئین بدون به خطر انداختن پرنده می­باشد.

کاربردهای دیگر

ژنوم جوجه­ها به شکل گسترده­ای برای بررسی بیماری­های خود ایمنی مورد استفاده قرار می­گیرد (Rose, 1994). زیرا مارکرهای ژنتیکی، تفکیک پذیری بالایی از نقشه لینکاژی لوکوس­های ناحیه خاصی از کروموزوم که ویژگی­های فنوتیپی را کنترل می­کنند، نشان می­دهند. جوجه­ها مدل­های بسیار ایده­آلی برای جراحی­های کوچک چشم، توسعه رویان، تشکیل اندام، ساختار رگ­های خونی و توسعه و عملکرد سلول­های B می­باشند (Kohonen et al., 2007; Leng et al., 2004). جوجه­ها همچنین برای آدنوکارسینوم تخمدان[24]، که یکی از بزرگترین دلایل سرطان در زنان می­باشد، مورد استفاده قرار می­گیرند (Stammer et al., 2008). همچنین پژوهشگران نشان دادند که جوجه­ها مدل­های حیوانی بسیار مناسبی برای تحقیقات بر روی تصلب شرائین[25] هستند. زیرا سطح لیپوپروتئین موجود در آن­ها بسیار مشابه انسان می­باشد (Ayala et al., 2005). پیشرفت­های اخیر در زیست فناوری سبب تولید جوجه­های تراریخت به منظور مطالعه رشد آن­ها، مقاومت در برابر بیماری­ها و سرطان­ها شده است. توانایی تولید حیوانات تراریخت مقاوم به نوع خاص پاتوژن به دلیل کاهش هزینه­های مرتبط با درمان و ضررهای ناشی از بیماری، دارای اهمیت بسیار بالایی می­باشد. برای مثال، پس از تشخیص ژن Mx در جوجه­ها پژوهشگران توانستند با وارد کردن و بدست آوردن بیان بالا از این ژن، سطح مقاومت در برابر ویروس آنفلونزا را افزایش دهند (Li et al., 2007). تولید پرندگان تراریخت به شکل صنعتی می­تواند سبب بهبود ژنوتیپ های موجود، افزایش راندمان غذای مصرفی و کاهش چربی و کلسترول تخم شود (Mohammadabadi, 2007).

جدول 2- بیان موفق پروتئین های نوترکیب با استفاده از حامل های ویروسی.

Table 2 – Successful expression of the recombinant proteins using viral vectors.

نتیجه گیری

ویژگی­های بسیار مناسب جوجه­ها سبب شده که طی یک ده اخیر از آن­ها برای ایجاد تراریخت­ها و زیست شناسی تکاملی استفاده شود. فناوری­های مورد نیاز برای تولید پرندگان تراریخت و روش­های دستکاری تراریخت­ها و بیان ژن در طی دهه گذشته توانسته پیشرفت­های بزرگی را در صنعت پرندگان ایجاد کند. بررسی­ها انجام شده در این مقاله نشان داد که جوجه­ها مدل حیوانی مناسبی برای بررسی بسیاری از بیماری­های انسانی هستند، اما جوجه­های تراریخت می­توانند به عنوان مدل مناسب­تری برای پژوهش­های خاص دارویی و زیست فناوری مورد استفاده قرار گیرند. هنوز مشکلات عمده­ای باقی مانده، که باید قبل از تولید پرندگان تراریخت به آنها توجه ویژه و راهکارهای مناسبی برای آنها پیشنهاد نمود. تحقیقات انجام شده بر روی تراریخت­ها همگی بر روی انتخاب حامل مناسب برای انتقال موفق ژن مورد نظر تاکید دارند، زیرا سیستم پرندگان از نظر سلولی با پستانداران تفاوت کمی دارند. اما تقریبا تمامی محققین بر این عقیده هستند که جوجه­های تراریخت ابزاری قدرتمند و مفید برای تحقیقات در حوزه زیست فناوری محسوب می­شوند. به طور کلی تصور براین است که BDCs کشت داده شده برای مدت طولانی، می­تواند به سلول­های شبه ESC تبدیل شود. اما تاکنون گزارشی مبنی بر تولید سلولهای زایای شیمر با استفاده از سلول­های شبه ESC وجود ندارد. علاوه بر این مشکلات، ممکن است نگرانی­های روز افزون امنیت محصولات بدست آمده از پرندگان تراریخت، کاربرد عملی برخی از فناوری­های کارآمد و مفید را برای استفاده از ویروس­ها در آینده محدود کند. با توجه به سلول های هدف مختلف و روش های انتقال ژن در دسترس، ما معتقدیم هدف قرار دادن SSCs در شرایط آزمایشگاهی با استفاده از انتقال ژن بر اساس غیر ویروسی و تزریق مجدد آن­ها درون بیضه خروس مؤثر و کم هزینه ترین روش برای تولید پرندگان تراریخت می­باشد. اما نمی توان از PGCSها و سلول های بنیادی پرتوان به پاس ویژگی­های منحصر به فردشان در بهبود و افزایش راندمان تراریخت ها چشم پوشی نمود.

تشکر و قدردانی

از جناب آقایان پروفسور لی و هان به پاس زحمات و مشاوره­های خردمندانه، صمیمانه تشکر و  قدردانی می شود. همچنین از همکاران محترم جناب آقایان دکتر مجتبی طهمورث پور، دکتر احمد رضا بهرامی و دکتر حسام دهقانی که در بحث های علمی مقاله مروری همکاری شایسته ای داشتند صمیمانه سپاسگزاریم.