بررسی ساختار ژنتیکی سگ های بومی ایران با استفاده از اطلاعات ژنوم میتوکندری

بررسی ساختار ژنتیکی سگ­های بومی ایران با استفاده از اطلاعات ژنوم میتوکندری

محبوبه علیزاده¹، علی­اکبر مسعودی*²، رسول واعظ ترشیزی³، دامون الهیارخان خراسانی⁴

¹دانشجوی کارشناسی ارشد ژنتیک و اصلاح دام، دانشکدة کشاورزی، دانشگاه تربیت مدرس.

²استادیار گروه علوم دامی، دانشکدة کشاورزی، دانشگاه تربیت مدرس.

³دانشیار گروه علوم دامی، دانشکدة کشاورزی، دانشگاه تربیت مدرس.

⁴ فارغ التحصیل کارشناسی ارشد علوم دامی، دانشگاه آزاد اسلامی ورامین.

تاریخ دریافت: 09/08/1391، تاریخ پذیرش: 27/12/1391

چکیده

هدف تحقیق حاضر مطالعه ساختار ژنتیکی سگ­های بومی ایران و مقایسه با دیگر نژادهای خارجی است. برای این منظور نمونه­های خون از 93 قلاده سگ از جمعیت­های مختلف، از نقاط مختلف کشور جمع آوری گردید، همچنین به منظور مقایسه نتایج حاصل با دیگر نژادهای آسیایی و اروپایی، 655 توالی 582 جفت بازی از ناحیه کنترل ژنوم میتوکندری از بانک اطلاعات ژنوم دریافت شد. استخراج DNA کلیة نمونه­های خون صورت گرفت و برای تکثیر و تعیین توالی ناحیة کنترل ژنوم میتوکندری استفاده شد. با مطالعه توالی 582 جفت بازی ناحیة کنترل ژنوم میتوکندری، 25 هاپلوتیپ تشخیص داده شد. مقدار تنوع نوکلئوتیدی کل برای سگ­های بومی ایران 00704/0±01354/0 بدست آمد. نتایج آنالیز واریانس مولکولی با استفاده از روش F-Statistics مقدار معنی­داری را نشان داد (029/0=Fst و 000/0=P). مقادیر شاخص تثبیت با استفاده از این روش دارای دامنه­ای بین 02671/0- الی 37481/0 بودند. بر اساس این آزمون برخی از این جمعیت­ها بخصوص جمعیت تازی با جمعیت­های سرابی، بختیاری، بومی البرز و بومی غرب کشور، جمعیت سرابی با جمعیت­های کردی، سنگسری، البرز و بومی غرب کشور، جمعیت بختیاری با جمعیت­های بومی البرز و بومی غرب کشور و جمعیت اروپا با غرب آسیا با یکدیگر از نظر ژنتیکی متفاوت بودند (05/0>P). همچنین جمعیت­های تازی، سرابی و بومی غرب کشور با نژادهای اروپا و غرب آسیا اختلاف معنی­داری نشان دادند (05/0>P). جمعیت سگ­های بومی خراسان با همه جمعیت­های مورد بررسی شباهت ژنتیکی نشان داد (05/0

واژه­های کلیدی: سگ بومی ایران، تنوع ژنتیکی، ساختار ژنتیکی، هاپلوتیپ.

مقدمه

سگ نخستین حیوانی است که به دست بشر اهلی شده است و تفاوتهای ظاهری و رفتاری زیادی در گونه های این حیوان دیده می­شود (Pang et al., 2009; Ardalan et al., 2011; Ardalan, 2012). سگ­های اهلی (Canis familaris) همواره دوستان و ملازمان خوبی برای انسان­ها بوده­اند. نقاشی­هایی که در غارهای انسان­های نخستین کشف شده حاکی از این موضوع است که این دوستی حداقل سابقه­ای 16 هزار ساله دارد. در آن زمان انسان اولیه برای شکار و نگهبانی از خود، به نگهداری از سگ روی آورده است، امروزه این کاربرد سگ گسترش پیدا کرده، به طوری که از سگ به منظور شرکت در نیروهای پلیس برای کشف مواد مخدر و یا پیدا کردن افراد زنده زیر آوار و حتی مضنونین و قاچاقچیان استفاده می­شود.

تصور می­شود که سگ از اهلی شدن گرگ قهوای در شرق آسیا در حدود 16 هزار سال قبل ایجاد شده است. از گرگ­ها پنج زیر گونه Canis lupus lupus، Canis lupus chanco، Canis lupus pallipes، Canis lupus arabs و Canis lupus panbasilen شکل گرفته است، که از این پنچ زیر گونه چهار زیر گونه در اوراسیا و یک زیر گونه در شمال آمریکا زندگی می­کند (Tanab, 2006). از نظر مورفولوژی و اکولوژی، گرگ­ها تنها اجداد سگ­های اهلی هستند. زیر گونه Canis lupus lupus بیشتر در اروپا، Canis lupus chanco در شرق آسیا و اخیرا در شمال آسیا، Canis lupus pallipes در هند و جنوب شرق آسیا و Canis lupus arabs در عربستان، اسرائیل و سوریه یافت می­شوند (Tanabe, 2006). در بررسی Tanabe و همکاران (2006) بر روی 16 پروتئین چند شکل خون نشان داده شده است که Canis lupus chanco جد سگ­های آسیایی است. اگر چه تا کنون ثابت شده است که اجداد سگ­های اهلی (Canis Familaris)، گرگ قهوه­ای Canis Lupus است و بررسی­های انجام شده نشان می­دهد که اختلافی در حدود 6/4% بین DNA میتوکندری سگ­ها و گرگ­های امروزی وجود دارد و این اختلاف ناچیز نشان دهنده­ی نزدیکی بسیار زیاد این دو موجود به یکدیگر می­باشد (Pires et al., 2006). حوادث باستانی نشان می­دهد که سگ­های اهلی در 11500 سال قبل وجود داشته­اند با این حال فرضیه چگونگی و کجایی منشا گرفتن سگ­ها از مکان­های متعدد تأیید نشده است که ممکن است به دلیل وجود مشکلاتی در تشخیص گرگ­های کوچک و سگ­های اهلی و یا پایین بودن اقدامات باستان شناسی صورت گرفته در سراسر جهان باشد. با توجه به اولین مطالعه بزرگ روی DNA میتوکندری سگ­ها و گرگ، Pang و همکاران (2009) بیان داشته­اند که سگ­ها در زمان دورتری از 100 هزار سال قبل منشاء گرفته­اند و این خیلی نزدیکتر از چیزی است که حوادث باستانی نشان داده است. چندین اختلاف در زمان و مکان منشا گرفتن بر اساس گروه­های فیلوژنی توالی­های mtDNA سگ مشاهده شده است، با این حال در مطالعات اخیر پیشنهاد شده است که منشاء گرفتن در زمان­های اخیر احتمال بیشتری دارد (Pang et al., 2009).

عناصر ژنتیکی متعددی از قبیل نشانگرهای مایکروساتلایت که دارای تنوع آللی بالایی می­باشند جهت بررسی ساختار ژنتیکی جمعیت­های مختلف سگ استفاده می­شود از جمله می­توان به مطالعة Parra et al. (2008) که در سگ­های اسپانیا انجام گرفته است و همچنین مطالعة Brown et al. (2011) که در نژادهای اروپا و خاورمیانه صورت گرفته است، اشاره نمود. همچنین از توالی D-loop ناحیة ژنوم میتوکندری به علت دارا بودن ساختار خاص خود به عنوان ابزاری قدرتمند برای مطالعة ساختار ژنتیکی موجودات مختلف مورد استفاده قرار گرفته است (Larson et al., 2007; Amills et al., 2008).

توالی ژنوم میتوکندری جهت مطالعه­ی تکاملی موجوداتی که گونه­ی مشابهی دارند به طور وسیع مورد استفاده قرار می­گیرد. بسیاری از این مطالعات در ناحیهD-Loop  میتوکندری صورت می­گیرد، چرا که این ناحیه میزان بالاتری از تنوع را نسبت به دیگر قسمت های ژنوم میتوکندری نشان می­دهد (Cairn et al., 1987; Lutz et al., 1988). وجود این نواحی متغیر آن را به ابزاری مناسب جهت مطالعه تنوع و ارتباطات خطوط مادری در درون یک گونه مبدل کرده است (Pires et al., 2006; moridi et al., 2013). Pang et al. (2009) با استفاده از DNA میتوکندری سگ اهلی نشان دادند که مخزن ژنی سگ­ها اشتراکی جهانی دارد. مطالعات صورت گرفته هاپلوتیپ­های mtDNA سراسر جهان را در 6 گروه فیلوژنتیکی که کلاد[1] A تا F گفته می­شود و 10 زیرکلاد تقسیم­بندی نمودند (Vila et al.1997;Savolainen et al., 2002; Pang et al., 2009). این گروه­های فیلوژنی با فراوانی­های کم و زیاد در سراسر جهان مشاهده می­شوند (Angleby and Savolainen, 2005; Klütsch et al., 2011). تنوع بالاتر در سگ­های جنوب شرقی آسیا نسبت به دیگر مناطق نشان می­دهد که سگ­ها از جنوب شرقی آسیا خصوصا جنوب چین یا آسیای جنوب شرقی منشا گرفته­اند (Pang et al., 2009).

پرورش سگ توسط اقوام مختلف، عشایر و روستاییان، این حیوان را به گنجینه­ای زنده تبدیل نموده است که از هر لحاظ با روحیات و نیاز مردم کشور ایران همخوانی دارد. مقاومت بالا، فرمانبرداری، هوش سرشار، قدرت بدنی و تنوع ظاهری، همه به غنای این ذخایر افزوده­اند. اگر چه در دهه­های اخیر توجه زیادی به این حیوان در کشور نشده است اما هنوز هم در برخی از نقاط ایران جمعیت­هایی از سگ­های بومی ایران یافت می­شود به طوری که در حال حاضر جمعیت­های زیادی همچون تازی، سرابی، بختیاری، سنگسری، بلوچی، کردی، ترکمن، قفقازی، افشاری و پاکوتاه ایرانی در کشور یافت می­شود. گفته می­شود که سگ تازی یکی از قدیمی­ترین سگ­های دنیا با بیش از پنج هزار سال قدمت است (Ardalan et al., 2011). بسیاری از این سگ­ها به منظور شکار (همانند تازی، پاکوتاه و افشاری) و یا نگهبانی (سرابی، کردی، ترکمن، بلوچی و بختیاری) استفاده می­شوند.

در این بررسی با مقایسة ناحیة متغیر 1[2] (HV1) ژنوم میتوکندری در هشت جمعیت سگ بومی ایران، جایگاه­های نوکلئوتیدی متغیر، تنوع و ساختار ژنتیکی و ارتباط ژنتیکی این سگ­ها با برخی از جمعیت­های دیگر کرة زمین (اروپا و جنوب غرب آسیا) مورد مطالعه قرار گرفت. با استفاده از مقادیر شاخص تثبیت جمعیت­های موجود به میزان شباهت ژنتیکی و نحوة تلاقی­های صورت گرفته پی برده می­شود که می­توان با آگاهی از ساختار ژنتیکی این حیوانات برنامه­های اصلاح نژادی مناسبی را در این جمعیت­ها جهت حفظ تنوع ژنتیکی مطلوب در جمعیت و جلوگیری از افزایش همخونی بکار برد.

مواد و روش­ها

نمونه برداری و بدست آوردن توالی­های موجود از بانک اطلاعات ژنوم

برای اجرای این تحقیق نمونه خون از 93 قلاده سگ از جمعیت­های مختلف، همانند سگ تازی (8 نمونه)، سرابی (20 نمونه)، کردی (9 نمونه)، بختیاری (15 نمونه)، بومی خراسان (8 نمونه)، سنگسری (6 نمونه)، بومی البرز (19 نمونه) و بومی غرب کشور (8 نمونه) جمع­آوری شدند. کل محتوی DNA با استفاده از روش شستشوی نمکی (Miller et al., 1988) از نمونه­های خون جمع­آوری شده استخراج شد و به عنوان الگو برای تکثیر ناحیة کنترل ژنوم میتوکندری مورد استفاده قرار گرفتند. همچنین برای مقایسه با سایر جمعیت­های سگ موجود در دیگر نقاط جهان 655 توالی 582 جفت بازی متعلق به سگ­های اروپا و جنوب غرب آسیا از بانک اطلاعات ژنوم[3] (NCBI) دریافت شدند.

انجام واکنش PCR نمونه­ها و تعیین توالی محصولات PCR

با استفاده از توالی رفرنس DNA میتوکندری سگ اهلی (شماره شناسایی NC_002008)، پرایمر مستقیم با توالی 5'-CCGCCCTCCCTAAGACTCAAG-3' و معکوس با توالی 5'-GAGACCAAATGCGTGTAAGAC-3' برای تکثیر قطعه 1179 جفت بازی طراحی شدند. سپس واکنش­های PCR در حجم­های 30 میکرولیتری، حاوی 3 میکرولیتر بافر 10X PCR، 26/1 میلی مولار MgCl₂، 2/0 میلی مولار dNTPs، 27/0 میکرو مولار از هر پرایمر، 2 واحد آنزیم Taq پلیمراز و ^50 نانوگرم DNA انجام شدند. تمامی واکنش­های PCR با استفاده از برنامة استاندارد واکنش PCR صورت گرفتند که شامل 5 دقیقه جداسازی آغازین زنجیره­های الگو در دمای 95 درجة سانتیگراد ، 35 سیکل شامل یک دقیقه در 95 درجة سانتیگراد، یک دقیقه در 65 درجة سانتیگراد و یک دقیقه در 72 درجة سانتیگراد و در نهایت تکثیر نهایی زنجیرة الگو به مدت 10 دقیقه در دمای 72 درجة سانتیگراد بودند. سپس محصولات PCR بدست آمده پس از بررسی در ژل آگارز 1 درصد، با استفاده از کیت QIAGEN مطابق دستورالعمل شرکت سازنده خالص­سازی شدند. همه نمونه­های خالص­سازی شده (93 نمونه) با استفاده از کیت BigDye v3.1 توسط دستگاه 3730XL DNA analyzer (ABI, USA) تعیین توالی شدند.

بررسی تنوع موجود در توالی­های بدست آمده از جمعیت­های بومی

تمامی توالی­های ناحیة متغیر ابتدایی ژنوم میتوکندری بدست آمده در این مطالعه با استفاده از نرم­افزار BioEdit (Hall, 1999) ویرایش شده و به طول 582 جفت باز درآمدند. توالی­ها با استفاده از نرم­افزار CLUSTAL W (Thompson et al., 1994) توسط توالی مرجع زیر یکدیگر مرتب شده و بنابراین جایگاه­های حذف و اضافه[4] و انواع جهش­های بوقوع پیوسته تشخیص داده شدند. توالی­های مشابه به عنوان یک هاپلوتیپدر نظر گرفته شدند.

ترسیم درخت فیلوژنی و بدست آوردن هاپلوگروه­ها

درخت فیلوژنی با استفاده از نرم­افزار MEGA 5.10 (Librado and Rozas, 2009) و به روش Neighbour-joining (NJ) با 1000 بار نمونه­گیری مجدد برای هاپلوتیپ­های تشخیص داده شده و 655 توالی بدست آمده از بانک اطلاعات ژنوم (از نژادهای اروپایی، Border collie، Buhund، Bernese mountain dog، Finnish Spitz، Icelandic sheepdog، Landseer، Leonberger، Mongrel، Pointer،setter Irish ، Welsh corgi (pembroke)، Basset griffon، Drever، Galgo Español، German Shepherd، Pyrenean mastiff،Rottweiler ، Schnauzer،terrier Border ،retriever Golden ،Finnish Lapphund، Great Dane، Mongrel،retriever Labrador ، Bracco Italiano، French bulldog، Poodle، setter English، Dachshund wirehaired، Boxer، Greyhound و نژادهای جنوب غرب آسیا، Canaan، Saluki، Akbash، Kangal، Kars، Taigan) ترسیم شد. برای محاسبة فواصل ژنتیکی از روش F-statistics استفاده شد. از گروه­بندی ارائه شده توسط Vila و همکاران (1977)، Savolainen و همکاران (2002) و Pang و همکاران (2009)، جهت ترسیم درخت فیلوژنی و تقسیم­بندی هاپلوتیپ­ها مورد استفاده قرار گرفت.

بررسی ساختار ژنتیکی جمعیت­های مورد مطالعه

جهت بررسی ساختار ژنتیکی جمعیت­های مورد مطالعه و مقایسه آنها با توالی­های دریافت شده از بانک اطلاعات ژنوم، جدول تجزیه واریانس مولکولی[5] (AMOVA) و همچنین مقادیر شاخص تثبیت با استفاده از رابطة شمارة 1، توسط نرم­افزار ARLEQUIN 3.5 (Excoffier and Lischer, 2009) و به روش F-statistics بدست آمدند.

رابطة 1                                               

در رابطة فوق σ²_a واریانس بین جمعیت­ها و σ²_T واریانس کل می­باشند که از جدول آنالیز واریانس مولکولی بدست می­آیند.

نتایج

تنوع موجود در توالی­ها

با بررسی قطعة 582 جفت بازی ناحیة D-loop ژنوم میتوکندری سگ­های بومی ایران 38 جایگاه نوکلئوتیدی متغیر و 25 هاپلوتیپ بدست آمد. از بین 25 هاپلوتیپ شناسایی شده در این مطالعه 19 هاپلوتیپ قبلا شناسایی شده و در بانک اطلاعات ژنوم موجود است. از بین 38 جایگاه متغیر در 32 جایگاه جهش نوع جانشینی، در یک جایگاه جهش نوع جایگزینی، در یک جایگاه حذف نوکلئوتیدی، در سه جایگاه افزایش نوکلئوتیدی و در یک جایگاه حذف و جانشینی توأم رخ داده بود. مقدار تنوع نوکلئوتیدی کل برای تمامی توالی­های سگ­های بومی ایران 00704/0±01354/0 بدست آمد که نشان دهندة وجود تنوع ژنتیکی قابل قبولی در این سگ­ها می­باشد. همچنین در میان توالی­های بدست آمده از بانک اطلاعات ژنوم به ترتیب 49 جایگاه نوکلئوتیدی متغیر و 49 هاپلوتیپ در نژادهای اروپا و 56 جایگاه نوکلئوتیدی متغیر و 58 هاپلوتیپ در نژادهای جنوب غرب آسیا مشاهده شد، میزان تنوع نوکلئوتیدی در این نژادها به ترتیب 0078/0±01541/0 و 00805/0±01579/0 بود.

آنالیزهای فیلوژنی

درخت فیلوژنی به روش NJ برای ناحیه HVR1 هاپلوتیپ­های سگ­های بومی ایران به همراه توالی­های از چندین نژاد اروپا و جنوب غرب آسیا جهت مشخص نمودن ارتباط میان چهار کلاد ترسیم شد (شکل 1). توالی­های نژادهای خارجی با استفاده از بررسی­های in Silico بدست آمد. چهار کلاد A تا D در این درخت مشاهده شد. بیشترین تعداد هاپلوتیپ­های (19/74 درصد) بدست آمده به همراه نژادهای مختلف سگ از سراسر اروپا Spaniel English Springer، Greenland Dog، Husky siberian، Lcebandic Sheepdog، Alaskan Malamute، Swedish vollhund، Whippet، Setter Irish، Kangal، Greenland Dog، Terrier Airedale، Terrier Jack Russdl، German Shepherd، Greenland Dog، Husky، French Bulldog، Doberman Hybrid، Pointer، German Dog و نژادهای جنوب غرب آسیا Taigan، Canaan، Kangal، Akbash، Kars در درون کلاد A قرار گرفتند. کمترین تعداد هاپلوتیپ­ها (06/2 درصد از کل هاپلوتیپ­ها) شامل هاپلوتیپ H4 بودند که به همراه نژادهای سگ اروپا و جنوب غرب آسیا، Cao Da Serra Do Estrela، Golgo Espanol، Kars و Kangal در هاپلوگروه D قرار گرفتند. هاپلوتیپ­های H3، H5، H6، H9، H21 و H23 (58/19 درصد از کل هاپلوتیپ­ها) در درون هاپلوگروه B به همراه نژادهای مختلف سگ (نژادهای سگ Bearded Cowi، Collie، Dachshund، Doberman Pinscher، Lowchen، Vetriever Golden، Shetland Sheepdog، Terrier Bedlington، Finnish Spitz، Karelian Beardog، Canaandog و Giant Schnauzer از اروپا و Saluki، Canaan، Kangal از جنوب غرب آسیا) شاخه­بندی شدند. هاپلوتیپ­های H15 و H16 (22/3 درصد کل هاپلوتیپ) به همراه نژادهای Boxer، Border Collie، Giant Schnauzer، Golgo Espanol، Jamthund، Kangal و Kars در هاپلوگروه C قرار گرفتند. تعداد هاپلوگروه­ها در جمعیت­های سگ بومی ایران بین 2 و 3 هاپلوگروه متفاوت بود. جمعیت­های تازی، کردی، بومی خراسان و سنگسری شامل دو هاپلوگروه A و B، جمعیت بومی غرب کشور شامل دو هاپلوگروه A و C بودند. سه جمعیت باقی­مانده سه هاپلوگروه نشان دادند، هاپلوگروه­های A، B و D در جمعیت سرابی و بختیاری، و هاپلوگروه­های A، B و C در جمعیت بومی البرز دیده شد.

مقایسة ساختار ژنتیکی جمعیت­های مورد مطالعه و توالی­های بدست آمده از بانک اطلاعات ژنوم

وجود تمایز ژنتیکی معنی­دار ما را در اندازه­گیری اختلاف ژنتیکی کل موجود در زیر جمعیت­ها کمک می­کند و عامل Fst نشان­دهنده وجود تمایز در بین جمعیت­ها در سطوح مختلف ساختار ژنتیکی است. در روش F-Statistics همانطوریکه در جدول 1 مشاهده می­شود بیشترین مقدار واریانس برآورد شده به درون جمعیت­های مورد مطالعه (1/97 درصد) تعلق داشت. آنالیز واریانس صورت گرفته مقدار متوسط (9/2 درصد) را برای واریانس بین جمعیت­های مورد بررسی نشان داد (029/0ΦST=، 0000/0P=)، که نشان دهنده وجود تفاوت بین همه یا تعدادی از این جمعیت­ها در سطح احتمال 05/0 می­باشد. با معنی­دار بودن این تفاوت، مقادیر شاخص تثبیت (ΦST) بین جفت جمعیت­های مورد مطالعه با استفاده از روش F-Statistics برآورد شدند (جدول 2).

شکل 1- درخت Neighbour-joining ناحیة D-loop ژنوم میتوکندری. هاپلوتیپ­های بدست آمده در این مطالعه و توالی­های سگ­ها از بانک اطلاعات ژنوم. حروف A تا D لاتین نشان دهندة هاپلوگروه­های تعیین شده می­باشند.

Figure 1- Neighbour-joining tree for haplotypes of the dog mtDNA

جدول 1- تقسیم­بندی واریانس ژنتیکی بین و درون جمعیت­های مورد مطالعه و توالی­های بانک اطلاعات ژنوم با استفاده از آنالیز واریانس مولکولی (AMOVA) به روش F-Statistics در سطح احتمال 05/0.

Table 1- Genetic variation within and among populations using the F-Statistics method.

منبع واریانس Source of variation

مقادیر شاخص تثبیت با استفاده از این روش در دامنه­ای بین 02671/0- (بین جمعیت بختیاری و بومی خراسان) الی 37481/0 (بین جمعیت سرابی و بومی غرب کشور) تخمین زده شد. مقادیر ΦST با سطوح معنی­دار مختلف نشان دادند که از جمعیت­های مورد مطالعه جمعیت تازی با جمعیت­های سرابی، بختیاری، بومی البرز و بومی غرب کشور، جمعیت سرابی با جمعیت­های کردی، سنگسری، البرز و بومی غرب کشور ، جمعیت بختیاری با جمعیت­های البرز و بومی غرب کشور و جمعیت اروپا با غرب آسیا با یکدیگر از نظر ژنتیکی متفاوت هستند (05/0>P). همچنین جمعیت­های تازی، سرابی و بومی غرب کشور با نژادهای اروپا و غرب آسیا اختلاف معنی­داری نشان دادند (05/0>P). جمعیت سگ بومی خراسان با همه جمعیت­های مورد بررسی شباهت ژنتیکی نشان داد (05/0

بحث

در مطالعه حاضر، ساختار ژنتیکی سگ­های بومی کشور با استفاده از اطلاعات ژنتیکی ژنوم میتوکندریایی مشخص شده و نتایج حاصل با اطلاعات موجود در دیگر جمعیت­های کره زمین مورد مقایسه قرار گرفت. درخت فیلوژنی برای هاپلوتیپ­ها و توالی­های بدست آمده از بانک اطلاعات ژنوم مشخص نمود که 25 هاپلوتیپ بدست آمده از سگ­های بومی ایران در چهار کلاد از شش کلاد فیلوژنی به همراه پنج زیر شاخه از 10 زیر شاخه مخزن ژنی و زیر هاپلوگروه غیر جهانی d2 قرار گرفتند. نتایج بدست آمده در این مطالعه با نتایج بدست آمده برای سگ­های غرب آسیا که تنوع ژنتیکی متوسطی را برای این سگ­ها گزارش کرده­اند، مطابقت دارند (Ardalan et al., 2011). وجود هاپلوتیپ­های موجود در آسیای جنوب شرقی در جمعیت­های سگ بومی ایران به همراه تنوع بالا­تر سگ­های آسیای جنوب شرقی مؤید این مطلب است که به جز هاپلوگروه d2 که احتمالا در غرب آسیا و از دو رگه گیری سگ و گرگ ایجاد شده است، بقیه هاپلوگروه­ها از آسیای جنوب شرقی منشاء گرفته­اند.

جدول 2- مقادیر شاخص تثبیت (Φ_ST) جفت جمعیت­های مورد بررسی بین توالی­های میتوکندریایی جمعیت­های مورد مطالعه و توالی­های بانک اطلاعات ژنوم با استفاده از روش F-Statistics در سطح احتمال 05/0.

Table 2- Index values (ΦST) between pairs of populations using the F-Statistics method.

تمامی جمعیت­های سگ بومی کشور هاپلوگروه A را نشان دادند که با یافته­های بدست آمده در مورد نحوة پراکنش این هاپلوگروه در سراسر کرة زمین مطابقت دارد (Savolienin et al., 2002; Pang et al., 2009; Ardalan et al., 2011). در بررسی Verginelli و همکاران (2005) که روی سگ­های باستانی ایتالیا مربوط به 3 تا 15 هزار قبل صورت گرفت، این سگ­ها به کلیدهای A، B و C متصل شدند. در این بررسی هاپلوتیپهای A11، A12، A13، A14، A15 و A65 مربوط به 9000 سال قبل، هاپلوتیپ­های A18، A19، A20، A63 و A67 مربوط به 3 هزار سال قبل، و هاپلوتیپ­های C1، C2، C3 و C4 مربوط به 4 هزار سال قبل می­باشد. از میان این هاپلوتیپ­ها، هاپلوتیپ­های A11، A18، A19، A20، C1و C3 در جمعیت­های سگ بومی ایران مشاهده شد. از آنجایی که هاپلوتیپ­های A11، A18 و A19 دارای فراوانی بالا در میان جمعیت­ها می­باشد، می­توان گفت که قدمت این جمعیت­ها به 3 تا 9 هزار سال قبل برمی­گردد. هاپلوتیپ­های  C1و C3 در میان دو جمعیت مجزا، بومی البرز و بومی غرب کشور مشاهده شد، این امر بیان می­کند که اگر چه این جمعیت­ها قدمت بیش از 4 هزار سال قبل داشته اند با این حال در این زمان بوده که رگه­های مادری جدیدی به این دو جمعیت افزوده شده است. وجود این هاپلوتیپ­ها در سگ­های بومی ایران بیان کننده این امر است که سگ­های موجود در ایران خیلی قبل­تر از این زمان وجود داشته­اند.

 بیشترین درصد هاپلوتیپ مشاهده شده در این مطالعه مربوط به هاپلوتیپ A11 می باشد این هاپلوتیپ نیز در سگ های اروپا فراوانی بالایی دارد. از میان سگ های اروپایی استفاده شده در این تحقیق سگ Rottweiler بیشترین هاپلوتیپ A11 را دارا بود در نتیجه می توان گفت سگ­های ایران به این نژاد نزدیک تر است. همچنین این هاپلوتیپ دارای بیشترین فراوانی در غرب آسیا بود و چون تعداد این هاپلوتیپ در غرب آسیا بیش از دو برابر آن در اروپا است می­توان نتیجه گرفت که سگ های ایران به غرب آسیا نسبت به اروپا نزدیکترند.

آنالیز واریانس مولکولی با استفاده از روش F-Statistics در سطح احتمال 05/0 مقدار معنی­داری را از تفاوت­های بین جمعیت­ها مشخص نمود (جدول 1). بدلیل وجود تفاوت معنی­دار بین جمعیت­های مورد بررسی، می­توان با استفاده از مقادیر شاخص تثبیت، کلیة جمعیت­ها را مورد مقایسه قرار داد (جدول 2). جمعیت بومی خراسان با همه جمعیت­ها و همچنین با توالی­های بدست آمده از بانک اطلاعات ژنوم شباهت ژنتیکی نشان دادند که علت این امر می­تواند مهاجرت و یا انتقال زیاد این حیوان از شرق به غرب و نواحی مرکزی ایران در گذشته و حال باشد که این امر با در نظر گرفتن راه ابریشم که از خراسان وارد ایران و سپس به نواحی شمال و غرب ایران کشیده می­شود بعید به نظر نمی­رسد. جمعیت تازی با دیگر جمعیت­ها به جز جمعیت کردی، سنگسری و بومی خراسان اختلاف معنی داری نشان داد. سگ تازی از نوع شکاری بوده و از نظر فنوتیپی ساختار مشخصی دارد. از آنجایی که سگ­های شکاری در قدیم کاربرد زیادی داشته و خالص بودن این سگ­ها برای فنوتیپ مناسب اهمیت زیادی داشته است، احتمالاً تلاقی زیادی بین این اکوتیپ با دیگر جمعیت­ها صورت نگرفته است و این امر دلیلی برای متفاوت بودن آن با دیگر جمعیت­ها است. متفاوت نبودن جمعیت سگ سنگسری، بومی غرب کشور و بومی البرز، با همدیگر نشان از عدم کنترل تلاقی­های بین جمعیتی می­باشد. همچنین متفاوت نبودن برخی از این جمعیت­ها با نژادهای اروپا و غرب آسیا می­تواند به خاطر گستردگی جهانی بسیاری از هاپلوتیپ­هایی باشد که در اغلب جمعیت­ها به صورت مشترک دیده می­شود. باید بیان نمود که عدم وجود مانعی برای جلوگیری از مهاجرت و انتقال این حیوان از یک جمعیت به جمعیت دیگر علت اصلی شبهاهت برخی از این جمعیت­ها می­باشد. البته امکان این امر وجود دارد که کلیة جمعیت­های سگ موجود در ایران از نظر ژنتیکی با یکدیگر متفاوت بوده و هر یک جمعیتی مجزا را تشکیل دهند. بطورکلی جمعیت­های سرابی و تازی با یکدیگر و با دیگر جمعیت­ها متفاوت بوده و می­توان هر کدام از این سگ­ها را یک جمعیت مجزا در نظر گرفت.

اطلاعات حاصل از آزمایشات ژنوم میتوکندری نشان می­دهد که سگ یکی از حیواناتی است که بر خلاف سایر حیوانات اهلی و دست­آموزی که در حال حاضر در ایران یافت می­شوند در ایران اهلی نشده و محل اهلی شدن آن مناطقی از جنوب شرق آسیا می­باشد (Pang et al., 2009)، که این امر با توجه به اینکه تنوع و هاپلوگروه­های شناسایی شده در سگ­های بومی ایران (5 زیر شاخه از 10 زیر شاخه مخزن ژنی) کمتر از شرق آسیا  بخصوص چین (10 زیر شاخه مخزن ژنی) است تایید می­شود. وجود راه ابریشم به عنوان یک موقعیت استراتژیک سبب شده که ایران محل عبور بسیاری از تجار و کاروان­ها باشد. این راه که از شرق ایران شروع و از شمال غرب ایران خارج می­شود سبب اتصال کشورهای جنوب شرق آسیا به اروپا و آفریقا می­شود. این امر سبب شد که ایران به عنوان گذرگاهی برای ورود سگ­ها به اروپا و آفریقا تبدیل گردد. نتایج حاصل بیانگر تنوع قابل قبول در جمعیت­های موجود سگ­های بومی کشور می­باشد که مشابه اطلاعات بدست آمده قبلی است (Ardalan et al., 2011). اگر چه تنوع نژادهای اروپا در این مطالعه بیشتر از جمعیت­های سگ بومی ایران بود اما باید در نظر داشت که تعداد نمونه­های استفاده شده برای اروپا سه برابر نمونه­های ایران است. از طرفی باید خاطر نشان کرد که پرورش سگ در اروپا از اهمیت زیادی برخوردار است که باعث شکل­گیری کلونی­هایی شده است که با روش­های اصلاح نژادی مدیریت می­شوند و جلوگیری از اختلاط نژادهای موجود از اولویت­های اصلاح نژادی آنها می­باشد. در صورتیکه در کشور پرورش­دهندگان این حیوانات به صورت غیر رسمی و ناآگاهانه برای اهداف اقتصادی خود تلاقی­های نامناسبی را انجام می­دهند که خود در اغلب اوقات باعث افزایش هم خونی­های نژادی و به دنبال آن کاهش تنوع جمعیتی می­شود. این اولین مطالعه­ای می­باشد که خطوط ژنتیکی مادری و ساختار ژنتیکی جمعیت­های سگ بومی کشور را با استفاده از توالی­های ناحیه متغیر ژنوم میتوکندری مورد آنالیز قرار داده است و نتایج بدست آمده اختلاط حاصل از جمعیت­های مختلف را در شکل­گیری جمعیت فوق بسیار محتمل می­داند. از سویی باید خاطرنشان کرد که در حال حاضر قوانین نظارتی و حمایتی برای پرورش سگ و همچنین مراکز نگهداری استاندارد همراه با ثبت مشخصات و پرورش عملی جهت حفظ و حراست از جمعیت­های موجود سگ در ایران وجود ندارد، چه بسا بسیاری از افراد پرورش این حیوان را به دلیل مسائل عقیدتی نادرست می­دانند. در راستای حفظ ذخایر ژنتیکی بومی کشور و برای احیاء و اصلاح نژاد این جمعیت­ها که در شکل­گیری نژادهای سگ اروپا و آفریقا تأثیر بسزایی داشته­اند، باید قوانین حفاظتی، مراکز اصلاح نژادی و آزمون­های ژنتیکی ویژه­ای در نظر گرفته شود.

تقدیر و تشکر

تحقیق حاضر با حمایت مالی پلیس مبارزه با مواد مخدر ناجا انجام شده است که بدین وسیله از همکاری صمیمانه آنها تقدیر و تشکر شایسته به عمل می آید.