بررسی تنوع ژنتیکی گاندو، کروکودیل پوزه کوتاه ایرانی (Crocodylus Palustris)، با استفاده از توالی یابی نواحی D-Loop و Cyt b میتوکندری

بررسی تنوع ژنتیکی گاندو، کروکودیل پوزه کوتاه ایرانی (Crocodylus Palustris)، با استفاده از توالی یابی نواحی D-Loop و Cyt b میتوکندری

احمد افشاریان¹، محمدرضا نصیری²*، اسماعیل ابراهیمی³، علی جوادمنش⁴

¹ دانشجوی مقطع دکتری، گروه علوم دامی، دانشگاه فردوسی مشهد، مشهد، ایران.

² استاد، گروه علوم دامی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه فردوسی مشهد، مشهد، ایران.

³ دانشیار، گروه بیومدیکال مولکولی، دانشگاه آدلاید استرالیا.

⁴ استادیار، گروه علوم دامی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه فردوسی مشهد، مشهد، ایران.

تاریخ دریافت: 19/05/1396، تاریخ پذیرش: 14/07/1396

چکیده

شناسایی ویژگی‌های ژنتیکی تمساح پوزه کوتاه ایرانی (گاندو)، در برنامه‌ریزی مدیریتی به منظور حفاظت و نگهداری آن نقش بسیار مهمی دارد، لذا این پژوهش با هدف، بررسی ژنتیکی کروکودیل پوزه کوتاه ایران بر اساس مطالعه جمعیتی نواحی ثابت و متغیر ژنوم میتوکندری انجام گردید. بدین منظور، 12 نمونه بافت پوست و خون از سه منطقه مختلف شهرستان چابهار جمع‌آوری و پس از استخراج DNA، نواحی ثابت و متغییر ژنوم میتوکندری Cyt b و D-loop با استفاده از روش PCR تکثیر گردید. محصولات PCR توالی یابی و سپس آنالیز نتایج با استفاده از نرم‌افزارهای بیوانفورماتیک و مبتنی بر داده‌های نوکلئوتیدی و کدون‌های پروتئینی انجام گرفت. نتایج این تحقیق نشان داد که تمامی نمونه‌های مورد مطالعه، دارای توالی نوکلوتیدی یکسان هستند و هیچ تنوع ژنتیکی در بین این نمونه‌ها یافت نشد. نزدیکترین گونه به گاندو، گونه Crocodylus palustris و سپس گونه C. porosus بدست آمد. مقایسه توالی‌ها نشان دهنده وجود 12 جایگاه پلی‌مورفیک در بین 1156 جایگاه مورد مطالعه بود و 5 هاپلوگروپ معرفی گردید. لذا، با توجه به عدم مشاهده تنوع ژنتیکی در بین نمونه‌های مورد مطالعه، استفاده از برنامه‌های حفاظتی جهت افزایش تنوع ژنتیکی در گاندو امری بسیار ضروری به نظر می­رسد.

کلمات کلیدی: تمساح گاندو، تنوع ژنتیکی، درخت فیلوژنتیک، ژنوم میتوکندری.

مقدمه

جنس کروکودیل شامل تعداد زیادی از گونه‌های کورکودیل می باشد که ساکن مناطق گرمسیری و نیمه گرمسیری نواحی آسیا، استرالیا، آفریقا و نیوزلند می­باشد (Brochu, 2003; McAliley et al, 2006). کروکودیل مردابی یا پوزه کوتاه (گاندو) با نام علمی Crocodylus palustris  اندازه متوسط از جنس کروکودیل است (بیشترین طول قد 4-5 متر) که از ایران به سمت شرق تا آسام هند و به جنوب تا سریلانکا پراکنش دارد و حوزة پراکنش آن در ایران غربی ترین نقطة پراکنش جهانی این گونه به حساب می‌آید (شکل 1). کروکودیل مردابی دارای پهن ترین پوزه در بین تمام اعضای جنس کروکودیلوس (Crocodylus) است و بنابراین بیشترین شباهت ظاهری را به آلیگاتورها دارد (Da Silva & Lenin, 2010).  اگرچه گونه C. palustris ساکن مرداب‌ها می‌باشند، اما بررسی ها نشان داده که این گونه بیشتر ساکن رودخانه‌ها، دریاچه‌ها و برکه‌ها بوده و به خوبی توانسته در برکه‌های مصنوعی و دست ساز، کانالهای آبیاری، دریاچة پشت سد، برکه‌های طبیعی نواحی هند، پاکستان، سریلانکا و ایران سازگار شود (Whitaker & Andrews 2003; Da Silva & Lenin, 2010).

شکل 1- A: پراکنش کروکودیل گونه C. palustris براساس مطالعه Whitaker and Andrews (2003). B: گاندو در ایستگاه تحقیقات زیست‌-محیطی ریکوکش چابهار، ایران.

Figure 1- A: Distribution of C. palustris crocodile according to Whitaker and Andrews Study (2003). B: Gando in the Environmental Research Station of Rikukash, Chabahar, Iran.

اطلاع از ساختار ژنتیکی جمعیت­ها می­تواند کمک بزرگی برای برنامه ریزی برای طرح­های اصلاح نژادی و از همه مهمتر، حفظ ذخایر ژنتیکی باشد. روش­های مولکولی و استفاده از نشانگرهای مولکولی در این زمینه یکی از بهترین گزینه‌ها به حساب می­آید، زیرا با توجه به اطلاعات زیادی که به دست می­دهد می­تواند نتایجی که از تجزیه و تحلیل رکوردها با روش­های آماری به دست آمده است را تأیید و تکمیل نموده و حتی ممکن است که آنها را رد کند (Naderi et al., 2007). به علاوه، استفاده از ژنتیک ملکولی فواید زیادی دارد که یکی از این فواید معنی دار تعیین ژنوتیپ افراد برای جایگاه خاصی است (Mousavizadeh et al., 2009) همچنین استفاده از نشانگرهای ژنتیکی در انتخاب و اصلاح نژاد حیوانات ممکن است به طور مهیجی پیشرفت ژنتیکی را تسریع کند (Javanmard et al., 2008) و مطالعه تنوع ژنتیکی نژادهای بومی برای حفاظت از منابع ژنتیکی ذخایر بومی لازم و ضروری است (Mohammadi et al., 2009). حفاظت باید بر اساس دانش عمیقی از منابع ژنتیکی نژادهای خاص باشد، لذا تلاش برای شناسایی و تعیین خصوصیات ژنتیکی نژادهای بومی و محلی بسیار اهمیت دارد (Zamani et al., 2013). مطالعات متنوعی با هدف طبقه بندی ژنتیکی جمعیت‌ها و گونه­های نزدیک به هم، بررسی امکان انشقاق گونه‌های مختلف از یک جد مشترک، مطالعه رابطه فیلوژنی هر موجود با سایر گونه­ها و نژادها و دستیابی به راهکارهایی برای حفظ ذخایر ژنتیکی گونه‌های مختلف کروکودیل، در کشورهای مختلف جهان انجام شده است (Brochu, 2000; Brochu et al., 2010; Brochu and Densmore, 2001; Gatesy et al., 2004;McAliley et al., 2006; Willis et al., 2007; Gatesy and Amato, 2008; Meganathan et al., 2010). این مطالعات به برنامه ریزی صحیح جهت حفظ بقای این گونه که در طبقه بندی کتاب سرخ اتحادیه جهانی حفاظت International Union for the conservation (IUCN) در طبقه آسیب پذیر قرار گرفته است، کمک شایانی می­نماید (Da Silva & Lenin, 2010 ). امروزه استفاده از روش‌های مولکولی مبتنی بر DNA در مطالعات تنوع و ساختار جمعیت­های کروکودیل در اولویت قرار گرفته است. در این بین توالی­یابی ژن­های میتوکندری یکی از کاربردی­ترین روش‌ها برای تعیین رابط فیلوژنتیکی بین جمعیت­ها و گونه­های نزدیک به هم محسوب می­شود (Bruford et al., 2003; Dolati et al., 2016). همچنین DNA میتوکندری نشانگر بسیار مناسبی برای تشخیص بین گونه­ای گروه‌هایی است که برای 100 تا 10000 سال از هم جدا بوده­اند و نیز به دلیل سرعت بالای تکامل DNA میتوکندری در مقایسه با DNA هسته­ای باعث شده که از آن برای مطالعات تکاملی استفاده گردد (Nassiri et al., 2010). DNA میتوکندریایی (DNA میتوکندری) در تشخیص گونه­ها و ترسیم روابط فیلوژنتیکی دارای مزایایی از جمله تعداد زیادی نسخه به ازای هر سلول، اندازه کوچکتر آن از DNA ژنومی، وراثت پذیری مادری، هاپلوئید بودن، عدم وجود نوترکیبی در آن­ها، وجود نواحی حفاظت شده و وجود نواحی حفاظت نشده­ای مانند ناحیه D-Loop برای مطالعات تکاملی گونه‌های وابسته می‌باشد (Bellagamba et al., 2001). شناسایی توالی ژن­های میتوکندری به عنوان مشخصه ژنتیکی ثابت محسوب می­شود و به تهیه شناسنامه ژنتیکی، میزان تنوع موجود در جمعیت، امکان تشخیص گونه­ها و نژاد­ها، نگهداری خلوص نژادهای بومی و به حفظ گونه­های بومی از خطر انقراض و اختلاط ژنتیکی با سایر نژاد­ها کمک می‌کند (Janke et al., 2005; Roos et al., 2007, Feng et al., 2010; Meganathan et al., 2010). بنابراین مطالعه ژنتیکی و فیلوژنتیکی کروکودیل پوزه کوتاه استان سیستان و بلوچستان به منظور دستیابی به اطلاعاتی از قبیل تنوع گونه‌ها و زیرگونه‌ها، اطلاعات در مورد منشأ اهلی شدن مبنای انجام این پژوهش قرار گرفت. در این پژوهش برای اولین بار در ایران، کروکودیل پوزه کوتاه ایران در منطقه چابهار از دیدگاه ژنتیکی، محاسبه پارامترهای ژنتیکی و تعیین نقشه میتوکندریایی آن بر اساس مطالعه جمعیتی نواحی ثابت و متغیر ژنوم میتوکندری که در معرض خطر انقراض می باشد، گزارش می‌شود.

مواد و روش ها

با هماهنگی و همکاری اداره محیط زیست منطقه چابهار (مختصات: 25° 17′ 31″ N, 60° 38′ 35″ E)، 12 نمونه بافت از بخش های سطحی پوست و خون از کروکودیل پوزه کوتاه ایرانی، از 4 منطقه این شهرستان جمع آوری و در داخل اتانول مطلق نگهداری شد. از آنجا که نمونه‌های بافت، دارای بافتی به شدت متراکم و دیر هضم بودند، مقدار 1/0 گرم از هر نمونه با استفاده از تیغ اسکاپل جدا شده و سپس با استفاده از نیتروژن مایع هموژن گردید. سپس استخراج DNA با انجام تغییراتی در کیت # K0721  GeneJET Genomic DNA Purification Kit  شرکت Thermo انجام شد. این تغییرات شامل افزایش مدت زمان هضم بافت با استفاده از پروتئیناز K به مدت 16 ساعت بود. مابقی مراحل با توجه به دستورالعمل کیت صورت گرفت. یک ناحیه متغیر و یک ناحیه حفاظت شده از میتوکندری به منظور بررسی پارامترهای ژنتیکی جمعیت مورد بررسی مورد مطالعه قرار گرفت. ناحیه مد نظر برای بخش ثابت کل ناحیه Cyt b و ناحیه مورد نظر برای بخش متغیر، ناحیه‌ای از منطقه کنترل ژنوم میتوکندری حاوی بخش D-Loop (Displacement Loop) بود. بدین منظور توالی میتوکندریایی مربوط به میتوکندری گونه Crocodylus palustris از بانک ژنی (Benson et al., 2013) دریافت شد (Accession Number: HM488007). همچنین به منظور افزایش ضریب دقت توالی مربوط به گونه های دیگر کروکودیل متعلق به جنس Crocodylus نیز دریافت شدند تا بر اساس نواحی حفاظت شده بین گونه ای طراحی پرایمر صورت بگیرد (جدول 1) (شکل 2). طراحی پرایمر بوسیله برنامه Primer Premier v.5 (Lalitha, 2000) صورت پذیرفت (جدول 2).

جدول 1- گونه های کروکودیل مورد مطالعه در طراحی پرایمر.

Table 1- Crocodile species that used to design primer pair.

شکل 2- تصویر شماتیک منطقه طراحی پرایمر برای تکثیر ناحیه Cyt b و بخشی از ناحیه کنترل میتوکندری کروکودیلوس پالوستریس.

Figure 2- Schematic showing the primer design of Cyt b and D-loop region of C. palustritis.

جدول 2- مشخصات پرایمرهای استفاده شده برای تکثیر ناحیه Cytbو بخشی از D-loop میتوکندری کروکودیلوس پالوستریس.

Table 2- The primer characteristics used for amplifications of Cyt b and D-loop regions of C. palustritis mitochondria.

واکنش زنجیره ای پلیمراز توسط دستگاه ترموسایکلر Biometra مدل T personal در 35 چرخه حرارتی و با حجم نهایی 50 میکرولیتر انجام شد. از کیت مسترمیکس PCR شرکت آمپلیکون (دانمارک) با غلظت MgCl2، 5/1 میلی مولار جهت تکثیر قطعات هدف استفاده گردید. به منظور تایید تکثیر ناحیه مورد نظر، طی واکنش PCR، الکتروفورز محصولات PCR بر روی ژل آگارز 5/1 درصد با رنگ آمیزی GelRed صورت گرفت. سپس 50 میکرولیتر از محصول PCR با استفاده از کیت GeneJET PCR Purification Kit  شرکت Thermo (امریکا) خالص سازی شد و به همراه 50 میکرولیتر از آغازگرهای رفت و برگشت با غلظت 10 پیکومول به منظور توالی یابی به شرکت ماکروژن کره جنوبی ارسال گردید. این نمونه‌ها با استفاده از دستگاه ABI 3130 به روش اتوماتیک سانگر توالی یابی شدند. داده‌های حاصل از توالی یابی ژنوم میتوکندریایی کروکودیل پوزه کوتاه پس از دریافت به منظور تصحیح خطاهای توالی یابی مورد بازبینی قرار گرفتند. بررسی اولیه توالی‌های بدست آمده با استفاده از برنامه Chromas Lite 2.01 (Mccarthy, 2005) انجام شد. جهت تعیین بالاترین همولوژی کروکودیل پوزه کوتاه از رویه بلاست نوکلئوتیدی تحت پایگاه NCBI (Sayers et al., 2011) استفاده شد. توالی مورد توافق (Consensus) بدست آمده بر اساس معیار اکثریت، با استفاده از نرم‌افزار (Swindell & Plasterer, 1997) SEQMAN تعیین و این توالی توسط ابزار BankIt پایگاه اطلاعاتی NCBI (Sayers et al., 2011) ثبت گردید. بررسی تنوع ژنتیکی در سطح نوکلئوتیدی به کمک ابزار آنلاین DIVEIN)) (Deng et al., 2010) و Arlequin suite ver 3.5 (Excoffier & Lischer, 2010) صورت پذیرفت. به منظور مقایسه داده‌های این مطالعه با دیگر مطالعات از توالی‌های مرجع ثبت شده در بانک داده NCBI موسوم به توالی های مرجع استفاده شد (Pruitt et al., 2007). بدین منظور توالی مایتوژنومیکس 13 گونه مربوط به جنس کروکودیل و همچنین توالی‌های مربوط به جنس Osteolaemus دریافت شد. همچنین از دو زیرخانواده Alligatorinae و Gavialinae  نیز به عنوان کلاستر‌های خواهری استفاده شد. همردیف سازی در سطح نوکلئوتیدی به کمک الگوریتم Clustal نسخه 2 (Larkin et al., 2007) صورت گرفت. رسم درخت فیلوژنتیکی به کمک روش‌های مختلف بنا به شرایط، شامل اتصال نزدیک[1] (Saitou & Nei., 1987)، امساک حداکثر[2] (Farris, 1970; Fitch, 1971)، روش حداکثر درست نمایی (Felsenstein, 1981) و استنباط بیزی بهبود یافته به کمک زنجیره مارکوف مونت کارلو (Yang & Rannala, 1997) بود. ابزار مورد نظر در آنالیز اتصال نزدیک و امساک حداکثر برنامه تجاری PAUP نسخه 4 (Swofford, 2003) و برای دو آنالیز حداکثر درست نمایی و آنالیز بیزی به ترتیب RAxML (Stamatakis, 2006) و PhyloBayes MPI   (Lartillot et al., 2013) انجام گرفت. به منظور ارزیابی و دستیابی به پارامترهای بهینه ، روش بوت استرپ (Stamatakis et al., 2008) و (Felsenstein, 1985) 100 چندگانه مکرر انجام شد. همچنین از شاخص‌های امتیاز حداکثر درست نمایی مقیاس شده و شاخص پایداری مقیاس شده (RC) (Farris, 1989) نیز استفاده شد. فاصله ژنتیکی بر اساس توالی نوکلئوتیدی و همچنین توالی کدکننده پروتئینی مربوطه در ناحیه Cyt b انجام پذیرفت. روش مورد استفاده روش Maximum Composite Likelihood بود و در محاسبه فاصله ژنتیکی، سه جایگاه هر کدون، به شکل مشترک مد نظر قرار گرفت.

نتایج و بحث

استخراج DNA از بافت در تمامی نمونه‌ها با موفقیت انجام شد. DNA‌های استخراج شده فاقد شکستگی می‌باشند که نشان دهنده کیفیت مناسب استخراج DNA و حداقل آسیب وارده به آن طی فرایند آماده سازی و استخراج می باشد (شکل 3).

فرآیند تکثیر قطعات مربوط به ناحیه Cyt b و ناحیه کنترل با موفقیت انجام گرفت. کیفیت قطعات تکثیر شده به کمک ژل آگارز 5/1 مورد ارزیابی قرار گرفت. با توجه به طول ژن Cyt b، دو محصول PCR با اندازه‌های 710 و 649 جفت باز (شکل A4 و B4) و برای بخش D-loop، محصول PCR به اندازه 842 جفت باز تکثیر شد (شکل C4).

توالی‌های حاصله از 12 نمونه از لحاظ کیفیت توالی‌یابی برای هر باز توسط نرم افزار Chromas Lite 2.01 و الگوریتم PHRED (Ewing et al., 1998) مورد آنالیز قرار گرفته و کیفیت توالی‌یابی برای هر باز مشخص شد. توالی‌هایی با کیفیت پایین بر اساس انتخاب بلندترین ناحیه با آستانه میانگین خطای کمتر از 1/0 درصد، از دو انتهای قطعات حذف شدند. در نتیجه توالی‌هایی با طول کوتاه‌تر از مقدار مورد انتظار برای نمونه‌ها حاصل شد.

شکل 3- نتایج استخراج DNA بر روی ژل آگارز.

Figure 3- Extracted DNA results on agarose gel.

شکل 4- نتایج تکثیر قطعات Cyt b و D-loop روی ژل آگارز. A: قطعه 710 جفت بازی Cyt b، B: قطعه 649 جفت بازی Cyt b، C: قطعه 842 جفت بازی D-loop. چاهک های خالی نشان دهنده کنترل منفی و مارکر استفاده شده 100+ شرکت Thermo می باشد.

Figure 4- Agarose gel electrophoresis of PCR products of Cyt b and D-loop region. A: 710 bp fragments of Cyt b PCR products, B: 649 bp fragments of Cyt b PCR products, C: 842 bp fragments of D-loop PCR products. Empty wells are negative PCR control and 100+ Marker (Thermo, USA) was used in all of gel electrophoresis.

به طور میانگین بیش از 97 درصد نوکلئوتیدهای این توالی ها صحت توالی‌یابی معادل 99 درصد را نشان دادند که نشان دهنده ضریب اطمینان بالا در نتیجه گیری بر اساس توالی‌های بدست آمده می‌باشد. از آنجایی که در طراحی پرایمرها نواحی همپوشان بین قطعات در نظر گرفته شده بود، با حذف توالی‌های نامرغوب از دو انتهای توالی‌ها یکپارچگی قطعات مورد مطالعه کاملا حفظ شده بود و در نتیجه یک قطعه به طول 1962 باز از ژنوم میتوکندری بدست آمد که شامل کل ناحیه Cyt b و بخشی از ناحیه کنترل می‌باشد (شکل 5).

شکل 5- توالی های بدست آمده بعد از پردازش دارای همپوشانی کافی به منظور یکپارچه سازی می­باشند.

Figure 5- Sequences obtained after processing, had sufficient overlap in order to assemble the consensus.

توالی‌های به دست آمده با نرم افزار DIVEIN و Arlequin suite v.3.5  بررسی شدند. این ابزار تعداد جهش مشاهده شده، جایگاه‌های پلی­مورفیک، سطح تنوع نوکلئوتیدی و ساختار و تنوع هاپلوتایپی را در جمعیت مورد مطالعه مشخص می نماید. نتایج نشان داد که در هر سه ناحیه مورد بررسی بین 12 نمونه مورد مطالعه هیچ اختلاف نوکلئوتیدی وجود ندارد و جمعیت در این بخش از ژنوم میتوکندری فاقد تنوع ژنتیکی می‌باشد. این پدیده می­تواند نشان دهنده شدت بالای همخونی و روابط شدید خانوادگی در جمعیت کروکودیل پوزه کوتاه مورد مطالعه باشد و به طور آشکاری نشان‌دهنده وضعیت بحرانی تنوع زیستی این جمعیت است. تنوع زیستی لازمه بقای یک گونه در محیط می باشد و سطح پایین تنوع، کل جمعیت را در خطر انقراض در مواجه با شرایط خاص مانند تغییرات اقلیمی و یا پیدایش بیماری‌های خاص قرار می دهد. تنوع ژنتیکی درون جمعیتی از دو لحاظ برای بقای بلند مدت جمعیت ها مهم می باشد. اول اینکه تنوع فنوتیپی وابسته به ژنوتیپ که تعیین کننده میزان سازگاری یک جمعیت می باشد محصول تنوع ژنتیکی است (Blows & Hoffmann, 2005؛Bell & Collins 2008; Hoffmann & Sgrò, 2011). ثانیا تنوع ژنتیکی خنثی (Neutral Genetic Diversity) در یک جمعیت طبیعی انعکاس دهنده هم‌خونی و رانش ژنتیکی است که هر دو مورد از عوامل مشخص کاهش توان بقای جمعیت­ها هستند (Reed & Frankham 2003; Puurtinen et al., 2004; O’grady et al., 2006). با این وجود نمی‌توان انتظار داشت که تنوع ژنتیکی خنثی مستقیما مترادف با تنوع در هر ویژگی فنوتیپیک خاصی باشد (Reed & Frankham, 2001)، اما بخاطر ارتباط آن با اندازه جمعیت موثر می تواند انعکاس دهنده پتانسیل سازگاری جمعیت ها در بلند مدت باشد (Frankham, 2005; Willi et al., 2006; Lanfear et al., 2014). در نتیجه کاهش تنوع ژنتیکی درون جمعیتی (چه تنوع ژنتیکی انطباقی و در نتیجه فشار انتخاب باشد و چه تنوع ژنتیکی خنثی و نهفته در ژنوم باشد) با افزایش خطر انقراض جمعیت‌های طبیعی مرتبط است.DNA میتوکندریایی چون تحت تاثیر نوترکیبی قرار نمی‌گیرد (زیرا هاپلوئید است)، تنوع خود را تنها مدیون انتخاب طبیعی است و در نتیجه تنوع ژنتیکی آن وابسته به اندازه جمعیت نیست. همچنین انتخاب شدیدی بر ضد جهش‌های مضر ژنوم میتوکندری در لایه زاینده جنس ماده صورت می‌گیرد که منجر به همگن شدن بیشتر سطح تنوع آن می‌گردد (انتخاب پس زمینه ای) (Stewart et al., 2008). با این حال چندین مطالعه در سالهای اخیر DNA میتوکندریایی به عنوان مارکر اندازه جمعیت را زیر سوال برده­اند (Ballard & Whitlock, 2004; Hurst & Jiggins, 2005; Bazin et al., 2006). مهمترین این مطالعات شواهدی مبنی بر اینکه تنوع ژنتیکی در DNA میتوکندریایی با اندازه جمعیت همبستگی ندارد را ارائه می‌دهد (Bazin et al., 2006). این نتایج با مطالعه و مقایسه گروه های تاکسونومیک بزرگ جانوری بدست آمده است. به عنوان مثال، سطح پلی مورفیسم بین مهره داران و بی مهرگان مشابه یکدیگر بوده‌اند، در حالیکه بی مهره گان اندازه جمعیت بسیار بزرگتری در طبیعت دارند.

نتایج بررسی فیلوژنتیکی بر اساس توالی کامل Cyt b کروکودیل پوزه کوتاه ایران با دیگر اعضای خانواده کروکودیلینه (taxid:8493) نمایش داده شده است (شکل 6). این مقایسه با استفاده از توالی‌های ژنوم مرجع هر گونه انجام شده است. به طور کلی 1149 جایگاه و 12 گونه مختلف خانواده کروکودیلینه در این بررسی مورد استفاده قرار گرفته است و نتایج بدست آمده مبتنی بر داده های نوکلئوتیدی و کدون­های پروتئینی به طور مشترک می‌باشد.

درخت فیلوژنتیکی بدست آمده براساس فاصله ژنتیکی و به کمک روش حداکثر درست‌نمایی ترکیبی بدست آمده است (شکل 7). برای محاسبه این مقادیر علاوه بر داده‌های نوکلئوتیدی از داده‌های پروتئینی و نرخ جهش در سه جایگاه کدون پروتئینی استفاده شده است. در نتیجه علاوه بر مدل تکاملی خنثی، مدل تکامل انطباقی نیز در محاسبات مد نظر قرار گرفته است. معیار فاصله ژنتیکی تعداد جایگزینی‌های نوکلئوتید در هر جایگاه بین توالی‌ها می­باشد.

همانطور که در شکل 7 مشاهده می شود، نزدیکترین گونه به گونه گاندو Crocodylus palustris یا ماگر است که مطابق با یافته های مورفولوژیکی می باشد که قبلا ارائه شده است. این نکته بدین مفهوم است که جایگاه رده بندی کروکودیل پوزه کوتاه به عنوان گونه  palustris از دیدگاه ژنتیک مولکولی قابل تایید است. از کلاستر خواهری بین این دو در ادامه با عنوان کلاستر گاندو یاد خواهیم کرد (شکل 6).

پس از ماگر نزدیکترین گونه به گاندو Crocodylus porosus یا کروکودیل آب شور می‌باشد. این در حالی می باشد که این کروکودیل از لحاظ مورفولوژیکی تفاوت های زیادی با گاندو دارد. به عنوان مثال کروکودیل آب شور بزرگترین خزنده دنیا محسوب می شود و طول جنس نر آن به حدود 3/6 بالغ می شود در حالیکه جنس نر گاندو حدود 4 الی 5 متر رشد می‌کند. این کروکودیل عمدتا در سواحل شرقی هند زندگی می‌کند و در نواحی دیگر هند به ندرت یافت می‌شود (Devos, 1984). تشابه بین این دو گونه ریشه در تاریخ تکامل آن دو دارد و اگر به خاستگاه هر دو گونه توجه شود، به کشور هند خواهیم رسید.

در حال حاظر ماگر و کروکودیل آب شور دو گونه از سه گونه کروکودیل می باشد که در هند زندگی می‌کنند. مطالعات متعدد دیگری نیز وجود دارند که خویشاوندی بین این دو گونه را مورد تایید قرار می‌دهند. با توجه به اینکه کروکودیل آب شور و کروکودیل سیامنسیس تشکیل یک کلاستر خواهری را می دهند. این کلاستر در ادامه با عنوان کلاستر پروسوس و کلاستر خواهری گاندو به عنوان یک کلاد گاندو معرفی می شوند (شکل 6).

شکل 6- درخت فیلوژنتیک بین گونه های مختلف خانواده کروکودیل و جایگاه گاندو در این خانواده. طول شاخه ها مبین فاصله ژنتیکی و رنگ هر یک نشان دهنده سطح اطمینان محاسبه بر اساس 100 تکرار آزمون بوت استرپ می باشد. خط چین قرمز نشان دهنده کلاستر خواهری گاندو، خط چین آبی نشان دهنده  کلاستر پروسوس و خط چین سبز نشان دهنده کلاد گاندو می باشد.

Figure 6- Phylogenetic tree of different species of crocodylinae family and Gando position in this tree. The length of the branches indicates the genetic distance and the color of each represents the confidence level of the calculation based on 100 repetitions of the Bootstrap test. The red dashed line represents the Gando's sister cluster, the blue dashed line represents the Prosus cluster and the green dashed line indicates the Gando's clad.

شکل 7- فاصله ژنتیکی بین گاندو و دیگر گونه های خانواده کروکودیلینه که بر اساس روش حداکثر درست نمایی بدست آمده است. مقادیر فاصله ژنتیکی در بخش پایینی جدول و مقادیر خطای استاندارد محاسبه در بخش فوقانی جدول گزارش شده است.

Figure 7- The genetic distance between Gando and other species of the crocodylinae family obtained based on the maximum likelihood method. The genetic distance values in the lower part of the table and the values of the standard error calculation are reported in the upper part of the table.

وجود رابطه خواهری بین کروکودیل آب شور و کروکودیل سیامنسیس و تشکیل کلاد با ماگر در چند مطالعه دیگر نیز گزارش شده است (Mcaliley et al., 2006; Meganathan et al., 2010). البته در مطالعات دیگری رابطه نزدیک بین کروکودیل آب شور و ماگر و تشکیل کلاد با کروکودیل سیامنسیس گزارش شده است (Densmore & Owen, 1989; Gatesy & Amato, 2008). مطالعاتی دیگری نیز با بررسی 12 ژن کد کننده پروتئین در میتوکندری وجود رابطه نزدیک بین کروکودیل سیامیس و ماگر و تشکیل کلاد با کروکودیل آب شور نشان داده شده است (Man et al., 2011). همین نتیجه در یک بررسی دیگر نیز تایید شده است (Oaks, 2011). در مطالعه ای مشابه قرار گیری ماگر، سیامیس و کروکودیل آب شور در یک کلاد بر اساس مطالعه کل DNA میتوکندری مورد تایید قرار گرفته است (Meredith et al., 2011).

باید توجه داشت که فاصله ژنتیکی بین گاندو و دیگر گونه‌ها، مانند کروکودیل گینه نو کمتر از فاصله آنها با کلاستر پروسوس می باشد، اما روند تکاملی بین آنها متفاوت از یکدیگر می باشد و در نتیجه گاندو با پروسوس تشکیل کلاد داده است و کروکودیل گینه نو در این کلاد قرار نگرفته است. با بررسی بانک ژنی، 16 توالی برای Cyt b در گونه Crocodylus palustris شناسایی شد. مقایسه این توالی‌ها با توالی Cyt b گاندو که در این مطالعه بدست آمد نشان دهنده وجود 12 جایگاه پلی مورفیک در بین 1156 جایگاه مورد مطالعه بود. 3 مورد از این جایگاه‌ها بصورت سینگلتون با دو واریانت می باشند و 9 جایگاه دیگر از نوع جایگاه‌های حاوی اطلاعات پارسیمونی هستند که در تعیین جایگاه هر نمونه در ساختار فیلوژنتیکی موثر می باشند (جدول 3 ).

جدول 3- جایگاه های پلی مورفیک در توالی های Cyt b گونه C. palustris (جایگاه های پارسیمونیک بصورت پر رنگ نمایش داده شده است).

Table 3- Polymorphic positions in the Cyt b sequence of C. palustris (parsimony positions were shown in bold).

تنوع هاپلوتایپی بدست آمده برابر 574/0 بود، که نشان دهنده میزان پراکنش بالایی در ساختار ژنتیکی کروکودیل ماگر می باشد. با آنالیز مجدد فیلوژنتیکی بر اساس مجموعه توالی های Cyt b مربوط به مطالعات مختلف در کنار نتایج این مطالعه به درخت فیلوژنتیکی جدیدی منجر گردید که نشان‌دهنده اختلاف درون گونه‌ای برای کروکودیل ماگر می‌باشد (شکل 8). حتی با استفاده از چندین نمونه مختلف بازهم تمامی اعضای گونه ماگر در یک کلاستر قرار می گیرند و با فاصله زیادی تشکیل یک کلاد با دو کروکودیل اب شور و پروسوس را می دهند که نشان دهنده صحت نتیجه گیری اولیه در مورد رابطه بین کلاستر پروسوس و گاندو می باشد. این مسئله بدین مفهوم است که تنوع درون گونه ای ماگر منجر به تغییر جایگاه آن در ساختار فیلوژنتیکی خانواده کروکودلینه نمی شود.

نتایج این مطالعه نشان داد که مطابق با یافته های مورفولوژیکی، نزدیکترین گونه از لحاظ ژنتیکی به گاندو، گونه Crocodylus palustris است. با این حال، با توجه به منطقه جغرافیایی نمونه‌های مورد بررسی، فاصله ژنتیکی بین این دو وجود دارد. نکته حائز اهمیت در این پژوهش، عدم تنوع ژنتیکی در میان گاندوهای سه منطقه مورد بررسی در شهرستان چابهار است. فقدان تنوع ژنتیکی در داخل یک گونه می تواند توانایی آن گونه در سازگاری با تغییرات شرایط محیطی را تحت تاثیر قرار داده و در نتیجه خطر انقراض آنها را افزایش بدهد. از آنجاییکه هدف نهایی برنامه‌های حفاظت از گونه‌ها، بقای بلند مدت آنهاست، حفاظت از تنوع ژنتیکی درون جمعیتی باید از جایگاه ویژه ای برخوردار باشد. لذا جلوگیری از هم خونی بیشتر در میان گاندوها با استفاده از برنامه‌های تلاقی مناسب پیشنهاد می‌گردد.

تشکر و قدردانی

این مقاله مستخرج شده از پروژه پژوهشی به شماره 100807 مصوب معاونت پژوهش و فناوری دانشگاه فردوسی مشهد می باشد. لذا، بدین وسیله از آن معاونت محترم تقدیر و تشکر می گردد. تصویب این پروژه از محل حمایت‌های مالی اداره کل حفاظت محیط زیست سیستان و بلوچستان می‌باشد که مراتب تشکر و قدردانی را از آن اداره کل محترم داریم. پروژه در آزمایشگاه دانشکده کشاورزی انجام گرفته و بدین ترتیب از مسئولان مربوطه کمال تشکر را داریم.

شکل 8- جایگاه کروکودیل­های گونه ماگر در قیاس با کلاستر پروسوس. تنوع درون گونه­ای ماگر باعث تغییر موقعیت آن نمی­شود.

Figure 8- Position of Mugger species of crocodylus in comparison to Crocodylus porosus cluster. Inter-species variation of the Mugger does not change its position.