بررسی اثر غلظت‌های مختلف تیمارهای هورمونی بر کشت درون‌شیشه‌ای انگور بیدانه قرمز

بررسی اثر غلظت­های مختلف تیمارهای هورمونی بر کشت درون­شیشه­ای انگور بیدانه قرمز

 احسان نوروزی¹، لطفعلی ناصری*²، رقیه نجف­زاده³

^{1 و 2}دانش­آموخته کارشناسی­ارشد و دانشیار علوم باغبانی، گروه علوم باغبانی، دانشگاه ارومیه، ارومیه، ایران.

 ³استادیار گروه گیاهان دارویی و معطر، مرکز آموزش عالی شهید باکری میاندوآب، دانشگاه ارومیه، میاندوآب، ایران.

تاریخ دریافت: 03/12/1395، تاریخ پذیرش: 21/06/1396

چکیده

انگور بیدانه قرمز یکی از ارقام مهم و با کیفیت انگور در ایران می‌باشد که در سال‌های اخیر توسط کشاورزان مورد استقبال زیادی قرار گرفته است. با توجه به اهمیت تکثیر انبوه این گیاه و تولید نهال­های سالم و به ویژه عاری از سرطان مو، در پژوهش حاضر اثر غلظت‌های مختلف تیمارهای هورمونی
بر پرآوری و ریشه­زایی درون­شیشه­ای رقم بیدانه قرمز با هدف ارائه دستورالعملی مناسب جهت تکثیر
درون­شیشه­ای آن مورد بررسی قرار گرفت. بدین منظور از محیط کشت MS حاوی غلظت‌های مختلف بنزیل­آمینوپورین (BAP) (25/0، 50/0، 1 و 2 میلی­گرم در لیتر) به همراه 2/0 میلی­گرم در لیتر
ایندول­استیک­اسید (IAA) برای پرآوری نمونه­ها و از ایندول­بوتیریک­اسید (IBA) و نفتالین­استیک­اسید (NAA) در غلظت­های 0، 8/0 و 6/1 میلی­گرم در لیتر برای ریشه­زایی نمونه­ها در قالب طرح کاملاً تصادفی استفاده شد. نتایج نشان داد که هورمون­های مورد استفاده اثر معنی­داری روی خصوصیاتی از قبیل تعداد گره، طول میانگره­، تعداد شاخساره، طول و قطر شاخساره، وزن تر و خشک شاخساره، تعداد و سطح برگ، شاخص کلروفیل، تعداد و طول ریشه، وزن تر و خشک ریشه­ در ریزنمونه­ها داشت. بین غلظت­های مورد استفاده این هورمون­ها نیز تفاوت وجود داشت. بر اساس نتایج، بیشترین پرآوری نمونه­ها در غلظت 25/0 میلی­گرم در لیتر BAP و بیشترین تأثیر بر میزان ریشه­زایی در غلظت 8/0 میلی­گرم در لیتر IBA به دست آمد. طبق این نتایج می‌توان از تیمارهای هورمونی مشخص شده جهت افزایش پرآوری و ریشه­زایی
درون­شیشه‌ای در رقم بیدانه قرمز انگور استفاده نمود.

کلمات کلیدی: انگور، ریزازدیادی، تیمارهای هورمونی، پرآوری، ریشه­زایی.

مقدمه

انگور با نام علمی (Vitis vinifera L.) یکی از مهم­ترین محصولات باغی جهان است که به لحاظ سطح زیرکشت و ارزش اقتصادی بالا، مورد کشت و کار قرار می­گیرد. ارزش این محصول به دلیل تولید فرآورده­های متنوع، بسیار بالا بوده و از این لحاظ نقش بسیار مهمی را
در اقتصاد کشورهای تولید کننده آن ایفاء می­کند (Zohouri, 2006). طبق گزارشات سازمان خواربار جهانی، میزان تولید جهانی انگور در سال 2015 تقریباً 75 میلیون تن بوده است که کشور ایران با تولید 2 میلیون و 251 هزار تن، در دنیا جایگاه مهمی داشته و در بین ده کشور برتر تولید کننده انگور، رتبه دهم را به خود اختصاص داده است (FAO, 2017). از طرف دیگر از لحاظ سطح زیرکشت و میزان تولید در بین سایر محصولات درختی در ایران، انگور در جایگاه اول قرار دارد. ارقام بسیاری از انگور در کشور مورد کشت و کار قرار می­گیرند که در این میان، رقم بیدانه قرمز یکی از ارقام بسیار مهم به لحاظ
تازه­خوری و نیز تولید کشمش است که محصول تازه و کشمش تهیه شده از آن کیفیت مطلوبی دارد. از طرف دیگر، جزء ارقام بومی استان آذربایجان­غربی می‌باشد که در سال‌های اخیر توسط کشاورزان مورد استقبال زیادی قرارگرفته و انتظار می‌رود در آینده نیز سهم مهمی از تاکستان‌های جدیدالاحداث را به خود اختصاص دهد (Jalili-Marandi, 2003).

منابع ژنتیکی در کنار آب و خاک یکی از سه نهاده پایه­ای تولید می­باشد. حفاظت و
بهره­برداری مؤثر از آن جهت افزایش و پایداری تولید اهمیت زیادی دارد (Bakhtiari et al., 2016). تاکنون از تکنیک درون­شیشه­ای برای باززایی یا تکثیر بسیاری از گونه­های گیاهی استفاده شده است (Zinhari et al., 2016). روش مرسوم تولید انگور، استفاده از قلمه است که در نتیجه تکثیر با این روش در صورت آلوده بودن بوته­های مادری، آلودگی به نهال­های دختری منتقل خواهد شد. بیماری سرطان مو ناشی از باکتری آگروباکتریوم (vitis Agrobacterium) از جمله بیماری­های بسیار شایع باغات انگور است که هیچ تضمینی برای صحت و سلامت نهال­های تولیدی حاصل از روش سنتی وجود ندارد.
در این میان، ریزازدیادی انگور یکی از راه­­حل­های موجود برای تولید نهال­های سالم و به ویژه عاری از سرطان مو می­باشد (Ashcan, 2008). تهیه مواد گیاهی سالم به عنوان پایه­های مادری جهت ازدیاد گیاه مادری، مؤثرترین روش می­باشد که به این منظور شیوه­هایی چون کشت مریستم و گرمادرمانی استفاده می­شود (Alizadeh, 2004). چرا که گیاهان تولید شده از مریستم معمولاً خصوصیات ژنتیک گیاهان مادری را به خوبی حفظ می­کنند. پایداری بالای گیاهان تولید شده از مریستم­ها احتمالاً به واسطه یکنواختی بیشتر در ماهیت دیپلوئیدی سلول­های انتهایی است و رشد و تمایز مریستم در محیط کشت نیز، تحت کنترل هورمون است. بنابراین، حضور هورمون جهت استقرار ریزنمونه­ها و رشد مطلوب بعدی آن­ها ضروری می­باشد. در کشت درون­شیشه‌ای گیاهان، تنظیم­کننده­های رشد مخصوصاً اکسین­ها و سیتوکینین­ها خیلی بارز هستند. در واقع می­توان­ گفت که کشت درون­شیشه‌ای بدون وجود تنظیم­کننده­های رشد غیرممکن است (Bakhshi-Khanikei & Farshadfar, 2005).

در این رابطه، ترکیبات هورمونی مختلف چون سیتوکینین­ها به تنهایی یا همراه با اکسین­ها با غلطت­های مختلف جهت استقرار مریستم مورد استفاده قرار گرفته­اند (Aazami, 2010). بدین منظور از محیط کشت کامل MS یا رقیق شده آن با غلظت نصف نمک­های ماکرو و محیط کشت WPM اصلاح شده در ریزازدیادی انگور استفاده شده است. در پژوهشیKalatehjari  (2004) گزارش کرد که علت پاسخ­دهی بهتر ریزنمونه­های رقم شاهرودی و بیدانه سفید انگور به محیط کشت MS در مقایسه با محیط کشت WPM در غلظت­های هورمونی یکسان، نسبت زیاد عناصرغذایی و نیتروژن محیط کشت MS
می­باشد. طبق نتایج Haddad و همکاران (2008) بیشترین طول شاخساره رقم بیدانه سلطانی،
18 روز پس از کشت ریزنمونه­ها در محیط MS دارای 2/2 میکرومولار در لیتر BAP و 5/0
میلی­گرم IBA بدست آمد. در پژوهشی Ibanez et al. (2003) تأثیر سیتوکینین و واکشت را بر پرآوری انگور رقم ناپلئون بررسی نمودند و گزارش کردند که از بین سه نوع سیتوکینین بنزیل­آدنین، 2- ایزوپنتینیل­آدنین و تیدیازورون، بنزیل­آدنین پاسخ­های مورفوژنیک بهتری را باعث شد. بخصوص غلظت­های 67/6 و 9/8 میکرومولار منجر به درصد جوانه­زنی 100 درصدی و ضریب تکثیر بالا شد. کشت ریز قلمه­ها در محیط دیگر، سرعت جوانه­زنی و به مقدار زیادی تولید شاخه­ها و جوانه­های محوری را به ازای هر ریزنمونه تا سومین واکشت افزایش داد. اما از آن به بعد گیاهچه­ها بشدت شیشه­ای شده و دچار زوال شدند. در دیگر مطالعات نیز به بررسی اثر غلظت­های مختلف هورمون­ها در کشت
درون­شیشه­ای ارقام مختلف انگور پرداخته شده است (Abido et al., 2013; Banilas & Korkas, 2007; Butiuc-Keul et al., 2009; Kalatehjari, 2004; Mharte et al., 2000; Wang, 2009; Yerbolova et al., 2013).
با توجه به اهمیت تکثیر انبوه این گیاه و تولید نهال­های سالم و به ویژه عاری از سرطان مو، در پژوهش حاضر اثر غلظت‌های مختلف تیمارهای هورمونی بر پرآوری و ریشه­زایی درون­شیشه­ای رقم بیدانه قرمز با هدف ارائه دستورالعملی مناسب جهت تکثیر درون­شیشه­ای آن و تعیین غلظت مناسب این هورمون­ها برای تولید گیاهان عاری از سرطان مورد بررسی قرار گرفت.

مواد و روش­ها

قلمه­های خشبی انگور رقم بیدانه قرمز
در اوایل فصل بهار 1391 از یک باغ مشخص و مطمئن در شهرستان ارومیه جمع­آوری شدند و پس از غوطه­وری در قارچ­کش (محلول بنومیل 1 درصد به مدت 10 دقیقه)، انتهای آن­ها به مدت 10 الی 15 ثانیه در ایندول­بوتیریک­اسید (2000
میلی­گرم در لیتر) آغشته گردیده و در بستر پرلایت در شرایط طبیعی گلخانه­ گروه علوم باغبانی دانشگاه ارومیه قرار داده شدند. پس  از گذشت 20 الی 30 روز، ریشه­زایی کافی در این قلمه­ها صورت گرفت. سپس این قلمه­ها به گلدان­ منتقل شده و در شرایط مناسب تغذیه­ای و رطوبتی جهت دستیابی به رشد کافی جهت گرفتن ریزنمونه در آزمایش­های بعدی برای کشت درون­شیشه­ای آن­ها در آزمایشگاه کشت بافت گروه علوم باغبانی قرار داده شدند. ریزنمونه­های مورد استفاده جوانه جانبی بودند که در شهریور ماه از گیاه جدا شدند و در الکل اتانول 70 درصد به مدت یک دقیقه، کلریدجیوه 1/0 درصد به مدت 3 دقیقه و هیپوکلریت­سدیم دارای کلر فعال 5 درصد به مدت 7 دقیقه ضدعفونی شدند (Salami, 2005).

جهت دستیابی به غلظت مناسب هورمون سیتوکینین BAP برای پرآوری، غلظت­های 25/0، 50/0، 1 و 2 میلی­گرم در لیتر BAP به همراه 2/0 میلی­گرم در لیتر ایندول­استیک­اسید (IAA) در محیط کشت پایه MS مورد آزمایش قرار گرفتند (Dezhmpour et al., 2007). صفات اندازه‌گیری شده شامل تعداد گره، طول میانگره­، تعداد شاخساره، طول و قطر شاخساره، وزن تر و خشک شاخساره، تعداد برگ، سطح برگ و شاخص کلروفیل پس از گذشت 30 روز از رشد ریزنمونه­ها بود (Aazami, 2010). بدین منظور تعداد گره، تعداد شاخساره و برگ تشکیل شده شمارش و یاداشت گردید. طول میانگره، طول و قطر شاخساره نیز توسط کولیس دیجیتال بر حسب میلی‌متر اندازه‌گیری شدند. سطح برگ توسط دستگاه سطح­سنج (Area Meter, AM 200, England) اندازه­گیری و بر حسب میلی­متر مربع بیان شد. شاخص کلروفیل نیز توسط دستگاه کلروفیل­متر (Konica Minolta 502, Japan)
بر حسب شاخص SPAD اندازه­گیری شد. وزن تر شاخساره نیز با استفاده از ترازوی حساس و وزن خشک توده گیاهی نیز بعد از قرار گرفتن گیاهک­ها در دمای 72 درجه سانتی­گراد آون به مدت 48 ساعت توسط ترازوی حساس
اندازه­گیری شد. برای تعیین غلظت مناسب هورمونی جهت ریشه­دار کردن گیاهک­های حاصل از آزمایش قبلی، هورمون­های اکسین IBA و NAA در 3 سطح 0، 8/0 و 6/1 میلی­گرم در لیتر در محیط کشت پایه MS استفاده شد (Hamidullah et al., 2013). صفات بررسی شده نیز شامل تعداد ریشه (از طریق شمارش)، طول ریشه (با استفاده از کولیس دیجیتال)، وزن تر ریشه­ (با استفاده از ترازوی حساس) و وزن خشک ریشه­ (بعد از خشک شدن در آون 72 درجه سانتی­گراد به مدت 48 ساعت با استفاده از ترازوی حساس) پس از طی چهار هفته از رشد گیاهک­ها بود (Hamidullah et al., 2013). لازم به ذکر است که کلیه محیط‌های کشت آماده شده در فشار 5/1 اتمسفر و دمای 121 درجه سانتی‌گراد به مدت 21 دقیقه در اتوکلاو استریل شدند. نمونه­های کشت شده نیز، در اتاق رشد با شرایط فتوپریود 16 ساعت روشنایی و 8 ساعت تاریکی با دمای 2±25 درجه سانتی­گراد و شدت نور50 میکرومول بر مترمربع در ثانیه قرار گرفتند.

این پژوهش در قالب طرح کاملاً تصادفی در 6 تکرار و هر تکرار شامل یک ظرف شیشه‌ای با دو ریزنمونه گیاهی انجام گرفت. تجزیه آماری داده‌ها با استفاده از نرم­افزار SAS (Ver: 9.1) انجام گرفت. بدین منظور آزمون نرمال بودن
داده­ها به روش میانگین­گیری در نرم­افزار Excel 2010 انجام گرفت. برای مقایسه­ میانگین‌ از آزمون چنددامنه‌ای­ دانکن (DMRT) در سطح احتمال %5 استفاده شد. جهت رسم نمودارها نیز از نرم­افزار Excel 2010 استفاده شد.

نتایج و بحث

نتایج نشان داد که هورمون­های BAP، IBA و NAA اثر معنی­داری روی خصوصیات مورد مطالعه در نمونه‌های حاصل از کشت درون­
شیشه­ای انگور داشت (P≤0.01) (جدول 1 و 2). همچنین بین غلظت­های مورد استفاده این هورمون­ها نیز تفاوت وجود داشت. نتایج نشان داد که با افزایش غلظت BAP تعداد گره تشکیل شده در نمونه­ها کاهش یافت، طوری که در تیمارهای دارای غلظت پایین BAP تعداد گره بیشتری به دست آمد. طبق این نتایج، بیشترین تعداد گره در غلظت 25/0 (66/15 گره) و پس از آن در غلظت­های 50/0 و 1 میلی­گرم در لیتر
(به ترتیب 83/12 و 50/13 گره) در مقایسه با غلظت 2 میلی­گرم در لیتر BAP (66/8 گره)
به دست آمد. بیشترین طول میانگره نیز در
گیاهک­های تولید شده از تیمارهای حاوی 25/0 و 50/0 میلی­گرم در لیتر BAP (به ترتیب 57/0 و 50/0 میلی­متر) به دست آمد (شکل 1).

تعداد شاخساره­های به دست آمده نیز در غلظت­های مختلف BAP متفاوت بود، طوری که بیشترین تعداد شاخساره در غلظت 25/0
میلی­گرم در لیتر (66/3 شاخساره) و کمترین آن در غلظت 2 میلی­گرم در لیتر BAP (16/2 شاخساره) مشاهده شد.

همچنین طول و قطر شاخساره­ به وجود آمده نیز در غلظت­های مختلف BAP متفاوت بود، طوری که بیشترین این مقادیر در غلظت­های 25/0 (به ترتیب 27/16 و 70/1 میلی­متر) و 50/0 (به ترتیب 23/16 و 72/1 میلی­متر) میلی­گرم
در لیتر BAP مشاهده شد (شکل 2).

جدول 1- تجزیه واریانس اثر غلظت­های مختلف هورمون BAP بر پرآوری درون­شیشه­ای انگور رقم بیدانه قرمز

Table 1- Variance analysis of the effects of various concentrations of BAP hormone on
in vitro proliferation in Red Seedless grape

^ns، ^*، ^**:  به ترتیب غیرمعنی­دار، معنی­دار در سطوح 5 درصد و 1 درصد.

^ns, ^*, ^**: Not significant, significant at p≤0.05 and p≤0.01, respectivly

جدول 2- تجزیه واریانس اثر غلظت­ هورمون­های مختلف بر ریشه­زایی درون­شیشه­ای انگور رقم بیدانه قرمز

Table 2- Variance analysis of the effects of various hormones concentrations on rooting in Red Seedless grape

^ns، ^*، ^**:  به ترتیب غیرمعنی­دار، معنی­دار در سطوح 5 درصد و 1 درصد.

^ns, ^*, ^**: Not significant, significant at p≤0.05 and p≤0.01, respectivly

شکل 1- اثر غلظت‌های مختلف هورمون BAP بر تعداد گره (a) و طول میانگره (b) در ریزنمونه‌های انگور رقم بیدانه قرمز. † ستون­های دارای حروف متفاوت اختلاف معنی‌داری در سطح احتمال %5 دارند.

Figure 1- The effects of various concentrations of BAP hormone on node number (a)
and nodal length (b) in Red Seedless grape explants. † Columns with different superscripts
are significantly different at P≤0.05.

          وزن تر و خشک شاخساره­ نیز در غلظت­های مختلف BAP متفاوت بود، به طوری که بیشترین این مقادیر در غلظت­ 25/0 میلی­گرم در لیتر BAP (به ترتیب 57/0 و 28/0 گرم) مشاهده شد. بین سایر غلظت­ها نیز از لحاظ آماری تفاوت معنی­داری مشاهده نشد (شکل 3).

    چنانکه در شکل 4 مشاهده می­شود، بیش­ترین تعداد برگ نیز در غلظت 25/0
میلی­گرم در لیتر BAP (83/38 برگ) به دست آمد. همچنین بیشترین سطح برگ در غلظت­های 25/0 ( 50/2052 میلی­مترمربع)، 50/0 (30/1832 میلی­مترمربع) و 1 میلی­گرم در لیتر BAP (70/1856 میلی­مترمربع) به دست آمد. همچنین بیشترین میزان کلروفیل در غلظت­ 25/0 میلی­گرم در لیتر BAP (SPAD 23/15) مشاهده شد. بین سایر غلظت­ها از لحاظ آماری تفاوت معنی­داری مشاهده نشد.

شکل 2- اثر غلظت‌های مختلف هورمون BAP بر تعداد (a)، طول (b) و قطر (c) شاخساره در ریزنمونه‌های انگور رقم بیدانه قرمز. † ستون­های دارای حروف متفاوت اختلاف معنی‌داری در سطح احتمال %5 دارند.

Figure 2- The effects of various concentrations of BAP hormone on shoots number (a), length (b) and diameter (c) in Red Seedless grape explants. † Columns with different superscripts are significantly different at P≤0.05.

شکل 3- اثر غلظت‌های مختلف هورمون BAP بر وزن تر (a) و خشک (b) شاخساره در ریزنمونه‌های
انگور رقم بیدانه قرمز. † ستون­های دارای حروف متفاوت اختلاف معنی‌داری در سطح احتمال %5 دارند.

Figure 3- The effects of various concentrations of BAP hormone on shoots fresh
(a) and dry weight in Red Seedless grape explants. † Columns with different superscripts are significantly different at P≤0.05.

شکل 4- اثر غلظت‌های مختلف هورمون BAP بر تعداد برگ (a)، سطح برگ (b) و شاخص کلروفیل (c) در ریزنمونه‌های انگور رقم بیدانه قرمز. † ستون­های دارای حروف متفاوت اختلاف معنی‌داری در سطح احتمال %5 دارند.

Figure 4. The effects of various concentrations of BAP hormone on leaf number (a), leaf area (b) and chlorophyll index (c) in Red Seedless grape explants. † Columns with different superscripts are significantly different at P≤0.05.

طبق این نتایج از بین چهار غلظت هورمون BAP مورد آزمایش، غلظت 25/0 میلی­گرم در لیتر بیشترین اثر را بر صفات مختلف اندازه­گیری شده داشت. طوری که بیشترین تعداد گره، طول میانگره­، تعداد شاخساره، طول و قطر شاخساره، وزن تر و خشک شاخساره، تعداد برگ،­ سطح برگ و شاخص کلروفیل در غلظت 25/0
میلی­گرم در لیتر BAP به دست آمد. اگرچه غلظت­های 50/0 و 1 میلی­گرم در لیتر BAP نیز دارای بیشترین طول میانگره­، طول و قطر شاخساره، تعداد برگ و سطح برگ بودند، اما غلظت 25/0 میلی­گرم در لیتر BAP به دلیل دارا بودن بیشترین صفات مورد مطالعه، غلظت مناسب و باصرفه­ای جهت پرآوری ریزنمونه‌های انگور رقم بیدانه قرمز می­باشد. آنچه که مسلم است غلظت­های مختلف BAP تأثیر متفاوتی در رشد و نمو ریزنمونه خواهند داشت. هورمون BAP از جمله تنظیم­کننده­های محرک رشد و تکثیر شاخه با قدرت ماندگاری بالا می­باشد (Bakhshi-Khanikei & Farshadfar, 2005).

مطالعات پیشین به خوبی نشان داده است که  BAPمؤثرترین هورمون سیتوکینین برای تحریک توسعه شاخه در گونه­ها و ارقام جنس Vitis  است (Lazo et al., 2016). در پژوهشی Kalatehjari (2004) گزارش نمود که انگور رقم شاهرودی در حضور سیتوکینین به همراه اکسین بهترین نتایج پرآوری را داشت. در پژوهشی دیگر Zhang et al. (2011) در تحقیقی دیگر اعلام نمودند که سیتوکینین به همراه اکسین در ارقام انگور بهترین نتایج پرآوری را داشت است. این نتایج با نتایج پژوهش حاضر همخوانی دارد. با توجه به اینکه شیشه­ای­شدن یا ویتریفیکاسیون (Vitrification) یکی از مسایل نامطلوب و معمول در ریز­افزایی است که گیاهچه­های دارای این عارضه، ظاهر آبکی، شفاف و اغلب دارای ساقه و برگ­های باد کرده می­باشند. بنابراین، احتمال موفقیت در استفاده از این گیاهچه‌ها برای فرآیند تکثیر، کم است (Bakhshi-Khanikei & Farshadfar, 2005). به دلیل اینکه هورمون سیتوکنین باعث تقسیم سلولی، حفظ پروتئین­ها و کلروفیل می­شود، در نتیجه با کاربرد بهینه هورمون BAP می­توان ریزنمونه­های با کیفیت بالایی بدست آورد. به این دلیل تقسیم سلولی بیشتر باعث افزایش سطح برگ، طول و قطر شاخه شده است. اما افزایش غلظت BAP و تقسیم سلولی بیشتر، از رشد قطری شاخساره جلوگیری می­کند. در این پژوهش پدیده شیشه­ای­ شدن فقط در غلظت 2 میلی­گرم در لیتر BAP مشاهده شد، به طوری که در تکثیر درون ­شیشه­ای انگور رقم Agiorgitiko نیز گزارش شده است که افزایش سطوح BAP میزان شیشه­ای ­­شدن را به شدت افزایش داد (Banilas & Korkas, 2007) که با نتایج پژوهش ما همخوانی دارد. با این حال مطالعات پیشین نشان داده است که غلظت­های بالاتر BAP باعث شیشه­ای­شدن گیاهچه­ها و تولید شاخه­های کوتاه­تر و دارای حالت جاروی می­شود. به نظر می­رسد که ارتباط مستقیم بین افزایش سطوح سیتوکینین و شیشه­ای­شدن به علت تقسیمات سریع سلولی و جذب بیش از حد آب می­­باشد (Banilas & Kokas, 2007). در پژوهشی Esnaashari et al. (2007) اعلام کردند که با در نظر گرفتن نقش شناخته شده اکسین­ها، سیتوکینین­ها و جیبرلین­ها در رشد و تقسیم سلولی و نتایج بی­شمار کاربرد تیمار­های هورمونی که از طریق تأثیرگذاری بر غلظت­ هورمون­های­ درونی نقش خود را ایفاء می­کنند. می­توان چنین اظهار نظر نمود که هر ژنوتیپ دارای مقادیر خاصی از هورمون­های درونی بوده و غلظت تیمارهای به کار گرفته شده بیشترین تأثیر را در چگونگی عملکرد و واکنش هورمون­های درونی نسبت به آنها دارد. با توجه به اینکه، یکی از روش­های حفظ تعادل متابولیسمی گیاهان در غلظت­های بالا، ممانعت از عمل و یا حتی تجزیه هورمون می­باشد، اثر قطعی برهمکنش اکسین­ها و سیتوکینین­ها با سایر هورمون­های درونی در مراحل پایانی رشد و نمو، همانند اسید آبسیزیک، اتیلن و جیبرلین­ها به اثبات رسیده است. از این پژوهش نتیجه گرفته می­شود که کاربرد 25/0 میلی­گرم در لیتر BAP میزان قابل قبولی از پرآوری شاخه را همراه با حداقل میزان شیشه­ای­شدن ایجاد نموده است که این می­تواند به دلیل تقسیم سلولی مناسب باشد که این خود نیز، باعث جذب آب، مواد کربوهیدراتی و معدنی به مقدار لازم می­شود. در نتیجه، گیاهچه­های حاصل شده از این طریق کیفیت بهتر، شکل ظاهری بهتر، توسعه سطح برگ و کلروفیل بهتری را در پی دارند. بنابراین، کاربرد سطوح پایین­تر BAP  (25/0 میلی­گرم در لیتر) را می­توان برای پرآوری شاخه انگور رقم بیدانه قرمز پیشنهاد کرد که با نتایج (Banilas & Korkas, 2007) در پژوهش بر ارقام دیگر انگور نیز مطابقت دارد.

بر اساس نتایج به دست آمده، هورمون IBA از نظر تولید تعداد ریشه نسبت به هورمون NAA در وضعیت بهتری قرار داشت، طوری که بیشترین تعداد ریشه در غلظت 8/0 میلی­گرم در لیتر هورمون IBA (16/18 ریشه) به دست آمد. همچنین کمترین تعداد ریشه در تیمار شاهد IBA (16/4 ریشه) مشاهده شد. بین غلظت­های 8/0 و 6/1 میلی­گرم در لیتر NAA نیز از لحاظ آماری تفاوت معنی­داری مشاهده نشد. طول ریشه به دست آمده نیز در غلظت­های مختلف IBA و NAA متفاوت بود، به طوری که بیشترین طول ریشه در غلظت 8/0 میلی­گرم در لیتر  IBA(33 میلی­متر) به دست آمد. کمترین طول ریشه نیز در تیمار شاهد این دو هورمون مشاهده شد (شکل 5). مراحل کشت درون­شیشه­ای ریزنمونه‌های انگور رقم بیدانه قرمز در شکل 7 آمده است.

شکل 5- اثر غلظت‌های مختلف هورمون IBA و NAA بر تعداد (a) و طول (b) ریشه در ریزنمونه‌های
انگور رقم بیدانه قرمز. IBA1: شاهد، IBA2: 8/0 میلی­گرم در لیتر، IBA3: 6/1 میلی­گرم در لیتر، NAA1: شاهد، NAA2: 8/0 میلی­گرم در لیتر و NAA3:  6/1 میلی­گرم در لیتر، † ستون­های دارای حروف متفاوت اختلاف معنی‌داری در سطح احتمال %5 دارند.

Figure 5- The effects of various concentrations of IBA and NAA hormones on root number. (a) and length (b) in Red Seedless grape explants. IBA1: control, IBA2: 0.8 mg L^-1, IBA3: 1.6 mg L¹, NAA1: control, NAA2: 0.8 mg L^-1, and NAA3: 1.6 mg L^-1, † Columns with different superscripts are significantly different at P≤0.05.

چنانکه در شکل­ 6 مشاهده می­شود، بیشترین وزن تر و خشک ریشه مربوط به دو غلظت 8/0 میلی­گرم در لیتر  IBA (به ترتیب  90/1 و 87/0 گرم) و 6/1 میلی­گرم در لیتر NAA (به ترتیب  70/1 و  86/0 گرم) بود. کمترین این صفات نیز در تیمار شاهد این دو هورمون مشاهده شد.

شکل 6- اثر غلظت‌های مختلف هورمون IBA و NAA بر وزن تر (a) و خشک (b) ریشه در ریزنمونه‌های انگور رقم بیدانه قرمز. IBA1: شاهد، IBA2: 8/0 میلی­گرم در لیتر، IBA3: 6/1 میلی­گرم در لیتر، NAA1: شاهد، NAA2: 8/0 میلی­گرم در لیتر و NAA3:  6/1 میلی­گرم در لیتر، † ستون­های دارای حروف متفاوت اختلاف معنی‌داری در سطح احتمال %5 دارند.

Figure 6- The effects of various concentrations of IBA and NAA hormones on root fresh (a) and dry (b) weight in Red Seedless grape explants, IBA1: control, IBA2: 0.8 mg L^-1, IBA3: † Columns with different superscripts are significantly different at P≤0.05.

شکل 7- مراحل کشت درون­شیشه­ای ریزنمونه‌های انگور رقم بیدانه قرمز. a: ریزنمونه، b: پرآوری ریزنمونه­ها، c: ریشه­زایی و d: گیاه کامل.

Figure 7- The steps of in vitro culture of in Red Seedless grape explants a: Explant, b: Proliferation of explants, c: Rooting, d: Complete plant.

با توجه به اینکه در سال­های اخیر اکثر توجه­ها به سوی روش­های ارزان و سریع در پروسه­های ریزازدیادی معطوف شده است، ریشه­زایی درون­شیشه­ای روش مناسبی جهت کاهش هزینه­های ریزازدیادی و مدت زمان پروسه تولید است. از طرف دیگر، در هر سیستم ریزازدیادی انتقال از محیط درون­­شیشه­ای به محیط گلدانی و سازگاری، یک فرایند مهم و اغلب محدودکننده می­باشد. چندین عامل در بقاء ریزقلمه­ها و موفقیت فرایند انتقال از یک مرحله با ویژگی هتروفیک به وضعیت کاملاً اتوتروف دخیل می­باشند. اندازه ریزقلمه­ها اغلب قدرت و توانایی آن­ها را در تحمل استرس­های دوره­ سازگاری تحت تأثیر قرار می­دهد و رطوبت نسبی محیط کشت نیز، پسابیدگی گیاهچه­ها را تا زمانی که ساختار کوتیکولی برگ­ها به اندازه کافی توسعه یافته و ضخیم­تر شوند، تحت تأثیر قرار می­دهد. سلول­های تمایزیافته نیاز به نوع و غلظت مناسبی از اکسین دارند تا بتوانند به علایم و سیگنال­های ارگانوژنیک پاسخ دهند. در این میان، برگ­ها یکی از منابع سازنده اکسین هستند و می­توان گفت با افزایش سطح برگ، سنتز درونی اکسین افزایش می­یابد که این به نوبه خود باعث افزایش تعداد و طول ریشه­ها می­شود. اکسین‌ها در تحریک تقسیم سلولی، افزایش طول سلول­ها، تحریک آغازیدن ریشه، تمایزیابی بافت‌های آوندی و افزایش حرکت مواد در آوندها نقش دارند. البته هورمون IBA نسبت به NAA در ریشه­زایی مؤثر می­باشد. همچنین وجود ریشه فرعی، جذب آب و مواد غذایی را افزایش داده و تنش­های به وجود آمده در اثر آب از دست­دهی گیاهان را در مرحله سازگاری کم می­کند (Bakhshi-Khanikei & Farshadfar, 2005).

طبق این نتایج، از بین هورمون­های اکسینی مورد استفاده هورمون IBA با غلظت 8/0 میلی­گرم در لیتر بیشترین اثر را بر صفات تعداد ریشه، طول ریشه، وزن تر و خشک ریشه داشت. در بیشتر تحقیقات انجام گرفته در زمینه­ ریزازدیادی انگور، اغلب ریشه­زایی به صورت درون­­شیشه­ای آزمایش شده استJalili-Marandi, 2003; Mharte et al., 2000 Wang, 2009)). در پژوهشی Abido et al. (2013) ریشه­زایی انگور رقم Alexandria را در محیط کشت MS با
غلظت­های متفاوت IBA و NAA بررسی کردند و بیشترین میزان ریشه­زایی را در غلظت 1
میلی­گرم در لیتر IBA به دست آوردند. سایر محققان (Butiuc-Keul et al., 2009) نیز گزارش کردند که IBA بیشترین تأثیر را در ریشه­زایی درون­شیشه­ای انگور رقم Perlette داشت. در سایر مطالعات نیز گزارش شده است که انگور رقم Agiorgitik بهترین نتایج ریشه­زایی را در محیط کشت MS با 1 میلی­گرم در لیتر IBA داشت. همچنین ریشه­هایی که در حضور NAA به خصوص در غلظت­های بالا به وجود آمده بودند، متورم و شکننده بودند و برخلاف آن، ریشه­هایی که در حضور IBA به وجود آمده بودند، وضعیت طبیعی­تری داشتند (Banilas & Korkas, 2007). نتایج این مطالعات با نتایج پژوهش حاضر مطابقت دارد.

نتیجه­گیری

انگور یک محصول استراتژی مهم باغبانی دنیا می­باشد که به لحاظ سطح زیرکشت و ارزش اقتصادی بالا، بیشتر مورد کشت و کار قرار
می­گیرد. با توجه به این که امروزه روش­های تکثیر انگور اکثراً سنتی بوده و از عواقب این روش تکثیر، می­توان به انتقال آلودگی، عملکرد پایین، محدودیت­های زمانی تکثیر و هزینه زیاد نام برد، بنابراین توسعه روش­های کشت درون­شیشه­ای این محصول مهم از اهمیت زیادی برخوردار می­باشد. نتایج این پژوهش نشان داد که کاربرد غلظت  25/0 میلی­گرم در لیتر هورمون BAP جهت پرآوری و 8/0 میلی­گرم در لیتر IBA جهت ریشه­زایی رقم بیدانه قرمز انگور
موفقیت­آمیز بود.